背景及目的据世界卫生组织报道,每年新增的癌症患者超过1000万,其中有20%-50%的患者是以疼痛为首发症状。疼痛是癌症患者最常见的伴随症状,最近一项调查显示,有超过50%的患者经历着中到重度的疼痛。虽然存在着多种针对癌症痛的治疗指南,其中包括世界卫生组织推荐的著名的“阶梯疗法”,但是仍有40%-80%的患者不能有效的控制疼痛。癌症导致的疼痛严重影响了患者的生活质量。在各种类型的癌症痛中,尤以骨癌痛最严重同时也最难治疗。因此探讨骨癌痛的产生与发展机制,寻找有效的控制骨癌痛的方法,称为当前亟待解决的问题。本研究通过建立大鼠胫骨癌痛模型,旨在探讨ephrinB2-EphB1受体信号通路在骨癌痛中的作用及机制,从而为寻找新的有效的治疗骨癌痛的方法奠定基础。方法(1)参照文献用大鼠乳腺癌细胞Walker256建立大鼠胫骨癌痛模型。检测肿瘤细胞植入对大鼠痛行为学的影响。利用western blot方法检测脊髓组织中ephrinB2和EphB1的表达变化趋势。利用免疫荧光方法进一步明确ephrinB2和EphB1在脊髓背角的分布与细胞定位。(2)为了明确ephrinB2-EphB1信号通路在骨癌痛中的作用,使用了外源性的信号通路抑制剂EphB2-Fc(5μg/20μl, i.t.)。检测EphB2-Fc对骨癌痛引发的痛行为学的影响。同时,利用免疫荧光技术观察EphB2-Fc对骨癌痛过程中脊髓背角c-fos, GFAP, IBA表达的影响。此外,利用western blot技术检测骨癌痛过程中p-NMDA受体(p-NR1,p-NR2A,p-NR2B)、p-Src及其后的Ca2+依赖的信号分子p-CREB, p-CaMKII和p-ERK的变化趋势以及EphB2-Fc对其变化的影响。此外,为了明确抑制剂对肿瘤生长的影响,通过HE染色和X线观察了胫骨组织内的肿瘤生长和骨破坏情况。(3)为了进一步明确ephrinB2-EphB1信号通路的作用机制,探讨究竟是正向信号还是反向信号参与了疼痛的调控,首先检测了ephrinB2-EphB1信号通路抑制剂EphB2-Fc(5μg/20μl, i.t.)对ephrinB2和EphB1的表达及活化的影响。随后又检测了信号通路的激动剂ephrinB2-Fc(2μg/20μl, i.t.)对ephrinB2和EphB1,NR1, NR2B活化的影响,以及其对痛行为学变化的影响。最后,为了检测ephrinB2-Fc的作用是否通过EphB1受体,在给予ephrinB2-Fc之前,先连续3天鞘内注射EphB2-Fc(5μg/20μl),然后再检测ephrinB2, EphB1, p-NR1, p-NR2B以及痛行为学的变化。为了探讨EphB2-Fc导致EphB1受体下调的机制,鞘内注射外源性的MMP-2抑制剂(MMP2i, 10μg/20μl)或MMP-9的抑制剂(FN439, 100μg/20μl)。利用western blot检测了MMP抑制剂对EphB2-Fc导致的受体下调的影响。(4)阿片类药物是目前临床上治疗癌症痛的主要药物,为了探讨EphB1受体介导的信号通路对吗啡耐受的影响,首先联合使用低剂量的EphB2-Fc(2μg/20μl, i.t.,每天一次,连续7天)和morphine (10 mg/kg, s.c.,每天两次,连续7天),通过行为学检测低剂量EphB2-Fc对骨癌痛过程中产生的吗啡耐受的影响。随后又在标准的吗啡耐受模型中验证了外源性抑制剂EphB2-Fc的作用。最后,用EphB1基因敲除小鼠(EphB1-/-)再次验证EphB1受体对吗啡耐受的影响。此外,还利用western blot技术检测了吗啡耐受过程中EphB1受体的表达及活化情况。结果(1)从肿瘤细胞植入后第7天开始,手术侧出现显著的热痛敏和机械痛敏表现,并随着时间的推移逐渐加重。手术对侧于术后第14天开始出现明显的痛行为学改变。EphB1和ephrinB2在对照组脊髓中的表达很低,然而随着肿瘤细胞植入,EphB1和ephrinB2的表达与活化呈时间依赖性的显著增高,并与痛行为学的变化相一致。增多的EphB1和ephrinB2主要集中表达与脊髓背角浅层的神经元和星形胶质细胞上。在初级传入纤维末梢和DRG中,增多ephrinB2主要表达在CGRP阳性的神经元上,而并非IB4阳性的神经元上。(2)连续鞘内注射ephrinB2-EphB1受体信号通路的抑制剂EphB2-Fc ( 5μg/20μl,每天1次,连续3天)显著抑制了肿瘤细胞植入导致的热痛敏、机械痛敏行为,以及其他疼痛相关的行为学改变(自发痛行为和运动诱发的痛行为)。同时,骨癌痛诱导的脊髓背角c-fos、GFAP和IBA的表达上调也随着EphB2-Fc的应用而被抑制。此外,反复使用抑制剂EphB2-Fc显著抑制骨癌痛导致的细胞内NMDA受体亚单位NR1和NR2B的活化,以及Src,ERK,CREB,CaMKII的磷酸化。NR2A的磷酸化水平在骨癌痛过程中各时间点无明显变化,EphB2-Fc对p-NR2A的表达也无明显影响。阻断ephrinB2-EphB1受体信号对胫骨内肿瘤的生长无明显影响。(3)鞘内注射EphB2-Fc有效的抑制骨癌痛导致的EphB1受体的上调与活化,但对ephrinB2无明显影响。鞘内注射ephrinB2-Fc明显促进EphB1受体的活化,对ephrinB2的表达与活化却起抑制作用。ephrinB2-Fc以EphB1受体依赖的方式诱导NR1和NR2B磷酸化,并产生热痛敏行为,阻断EphB1受体,ephrinB2-Fc的作用也随之消失。鞘内注射MMP-2的抑制剂MMP2i (10μg),或MMP-9的抑制剂FN439 (100μg)有效阻断了EphB2-Fc导致的EphB1受体的下调。(4)在骨癌痛大鼠中,使用低剂量EphB2-Fc(2μg/20μl)有效预防了吗啡耐受的产生,显著延长了骨癌痛过程中吗啡的镇痛作用时间。此外,在正常小鼠中,低剂量EphB2-Fc (2μg/10μl)显著延缓了急、慢性吗啡耐受的产生。在EphB1基因敲除小鼠(EphB1-/-)中,EphB1受体对吗啡耐受的作用再次被证实,抑制EphB1显著延缓了吗啡耐受的产生。同时利用western blot检测观察到,在急、慢性吗啡耐受过程中,EphB1受体的表达与活化明显上调,而应用EphB2-Fc后,这种上调显著被抑制了。结论1.肿瘤细胞植入能促进脊髓背角ephrinB2和EphB1的表达与活化。上调的ephrinB2和EphB1主要表达在脊髓背角浅层的神经元和星形胶质细胞上。2. EphrinB2-EphB1受体信号通路对骨癌痛的产生和维持均起着重要的作用。EphrinB2-EphB1受体的正向信号通路通过Src激酶激活NMDA受体亚单位NR1和NR2B,并进而激活其下游的Ca2+依赖信号分子,从而实现对骨癌痛的调控。而由Src激酶活化诱导的NR1和NR2B的磷酸化以及其下游信号通路的活化很可能是骨癌痛产生和发展的机制之一。3.基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9介导了抑制剂EphB2-Fc对EphB1受体的剪切作用。4.抑制EphB1受体活化能有效的预防吗啡耐受的产生。