目的:糖尿病是以血糖升高为特征的代谢性疾病,多由机体不能产生胰岛素或者产生的胰岛素数量不够或利用不足所引起。临床上多将糖尿病分为Ⅰ型糖尿病(胰岛素依赖性糖尿病)和Ⅱ型糖尿病(非胰岛素依赖性糖尿病)。无论是Ⅰ或Ⅱ型糖尿病,长期血糖升高,会使得beta细胞处于压力状态,最终都会导致beta细胞的损伤。糖尿病引起病人血糖升高的同时,还会引起一系列的并发症,如心血管疾病、眼部病变、糖尿病肾病以及神经损伤、糖尿病足等,这些并发症给病人带来了许多痛苦,同时也给其家庭以及社会带来沉重的负担。目前,全球范围内糖尿病患者已达到4.25亿人口,糖尿病已经不仅仅是威胁人类健康的风险问题,它早已成为一个全球性的社会危机。2017年,大约有4百万人死于糖尿病及其并发症。对于糖尿病的治疗,传统手段通常是采用控制饮食、口服降糖药物、胰岛素注射、胰岛素泵等等。但是传统治疗手段都只能在一定程度上缓解病人高血糖的症状,并不能从根本上治疗糖尿病。胰岛移植结合相应的免疫疗法,研究证明达到了胰岛素非依赖的治疗效果。但是由于供体极度缺乏,该方法尚未成为糖尿病的主要治疗手段。胚胎干细胞和诱导性多能干细胞作为具有自我更新、自我复制能力的多潜能干细胞,通过添加生长因子和化学小分子可以在体外分化成为胰岛素分泌细胞,可成为治疗糖尿病的新兴手段。如何从人多潜能干细胞获得足量、稳定、有功能的胰岛素分泌细胞依旧是当前研究的热点之一。从发育生物学角度来看,BMP、WNT、Hedgehog等信号通路作为内胚层发育过程中重要的调控因素对胰腺谱系特化有着重大的意义。本研究旨在调节相关信号通路,从而希望获得大量、稳定可重复的胰腺前体细胞,进一步分化可以得到胰岛素阳性细胞。同时探索了甲壳素微球对胚胎干细胞的支持作用,或可用于分化细胞体外的立体培养。方法:通过对胰腺前体细胞培养时间测试以及早期的RNA-seq(RNA sequencing转录组测序技术)分析,我们对内胚层发育过程中多条信号通路进行调控。通过流式细胞术、免疫荧光染色技术、实时荧光定量PCR技术(quantitative real-time polymerase chain reaction,q PCR)检测胰腺前体细胞标记物以及内胚层其他谱系标记物的表达变化情况。通过实时荧光定量PCR技术,免疫荧光染色技术,蛋白印记技术,从m RNA和蛋白水平检测对照组和BMP信号通路抑制后的实验组中WNT信号通路下游分子的改变。通过实时荧光定量PCR技术,免疫荧光染色技术对胰腺前体细胞进一步分化为成熟beta细胞进行检测。同时,在诱导性多能干细胞中对上述实验进行验证。另外,我们也测试了甲壳素相关生物大分子材料的细胞适合性。通过MTT检测甲壳素微球支撑下胰腺导管癌细胞、正常人肝脏细胞、人胚胎干细胞的生存情况。通过对与甲壳素微球共同培养的人胚胎干细胞进行钙黄绿素和碘化丙啶染色,检测人胚胎干细胞与甲壳素微球的位置关系和形态改变;通过实时荧光定量PCR技术对甲壳素微球支撑下人胚胎干细胞的自发分化结果进行检测。结果:通过对培养时间和内胚层分化中多条通路的测试,其中我们得到了较为有效和稳定的BMP抑制剂LDN193189和K02288提高了从定型内胚层到胰腺前体细胞胰十二指肠同源异型盒(PDX1)的表达水平;添加BMP通路的抑制剂LDN193189后,内胚层肝脏谱系标记物甲胎蛋白(AFP)表达下降。同时,我们也发现了小肠谱系的标记物尾端相关同源异型盒2(CDX2)表达量明显下降;观察WNT信号通路下游基因表达情况,以及WNT信号通路活化的转录因子beta-catenin表达和定位情况,发现BMP抑制后WNT信号通路活性降低。协同抑制WNT和BMP信号通路后,可以进一步提高胰腺前体细胞PDX1的表达情况;继续分化后可以得到INSULIN阳性的成熟beta细胞。材料方面,甲壳素微球可以支撑胰腺导管癌细胞、正常人肝脏细胞、人胚胎干细胞的存活;人胚胎干细胞可以在甲壳素微球的支撑下增殖、分化。结论:由定型内胚层细胞分化为胰腺前体细胞过程中测试得到的BMP信号通路抑制剂(LDN193189和K02288)可以促进胰腺前体细胞的分化效率;BMP信号通路抑制对胰腺前体细胞的促进作用是通过改变WNT信号通路活性实现的;BMP和WNT信号通路的双抑制可以进一步提高胰腺前体细胞PDX1的表达;胰腺前体细胞继续分化可以得到胰岛素分泌细胞。甲壳素微球可以作为支持胚胎干细胞增殖、分化的种子材料。