[研究目的]　　 TRPS1基因突变导致鼻-指-趾综合征(tricho-rhino-pharyngealsyndrome)其单倍表达不足导致人类骨骼毛发发育异常。研究发现，其编码的蛋白Trps1在肾脏发育过程中起到重要作用。Trps1基因敲除的胚胎小鼠肾脏中肾单位减少，肾脏发育不全。并且，Trps1作用于Bmp7（BoneMorphogeneticProtein7，骨形成蛋白第7因子）下游，介导由Bmp7诱导的间叶-上皮转换(Mesenchymal-to-epithelialtransition，MET)。Trps1基因敲除的肾脏间叶细胞不能被Bmp7诱导形成上皮细胞。鉴于Bmp7具有抑制TGF-beta诱导的上皮-间叶转换(Epithelial-to-mesenchymaltransition，EMT)的作用，并能够逆转慢性肾损伤导致的肾脏纤维化。但是作为Bmp7下游转录因子的Trps1是否参与肾脏上皮细胞向间叶细胞转换，并且其下游作用机制如何尚不清楚。为解决以上问题，我们在前期的实验基础上，从研究Trps1在成年小鼠肾脏的表达入手，设计了TGF-beta-Trps1-靶基因-EMT研究轴线，研究Trps1在TGF-beta诱导的EMT过程中的作用，以及Trps1对下游基因的调控在EMT过程中的作用机制，为深入研究EMT作用机制及探讨抑制/逆转EMT的可能性提供新的理论支持和实验依据。　　 [研究方法]　　 1.通过免疫组化、免疫荧光等手段，标记Trps1蛋白，检测Trps1在成年小鼠肾脏中的表达和分布情况。　　 2.建立单侧输尿管结扎小鼠模型，模拟肾脏纤维化EMT过程，通过检测肾脏纤维化过程中的各项指标，如纤维化程度（Ecad，a-SMA和Coil）及与肾脏纤维化有关的信号传导通路(TGF-beta-pSmad3)明确肾脏纤维化与Trps1表达水平的关系。　　 3.原代培养野生型（WT）及Trps1单倍表达不足(HT)小鼠肾脏近曲小管上皮细胞，通过TGF-beta诱导上皮细胞发生EMT，运用real-timePCR，Westernblot，免疫细胞染色等手段，检测Trps1在正常表达及表达不全(haploinsufficiency)的情况下，对上皮细胞发生EMT的影响，找出Trps1作用的下游目的基因，阐明Trps1调控EMT的分子机制。　　 4.运用siRNA(siRNA)干扰Trps1的下游目的基因，通过real-timePCR，Westernblot，免疫细胞染色等手段干扰Trps1下游目的基因是否能够抑制/逆转肾脏上皮细胞向间叶细胞转换。　　 [实验结果]　　 1.Trps1特异性表达于小鼠肾脏近曲小管上皮细胞。我们通过免疫组织化学染色方法发现Trps1表达于成年小鼠肾脏皮质。通过与肾小管各个不同节段的分子标的物做对比，我们发现Trps1特异性表达于肾脏近曲小管上皮细胞，其分布范围与近曲小管上皮细胞标的物villin的范围一致。并且，同时标的Trps1和villin的免疫荧光染色显示Trps1和villin共同表达于肾小管上皮细胞，其分布范围完全一致。　　 2.Trps1表达单倍不足(haploinsufficiency)促进单侧输尿管结扎(UUO)导致的肾脏纤维化。UUO导致肾脏间质纤维化，表现为肾小管萎缩以及肾小管间基质沉积。通过HE染色检查结扎过的WT和Trps1HT小鼠肾脏，我们发现病变肾脏均有不同程度的小管扩张，萎缩，间质增多以及间质细胞增生。然而，在Trps1表达单倍不足(HT)情况下，由于UUO导致的间质纤维沉积程度加重。通过免疫组织化学对比发现，Ⅰ型胶原染色程度在HT小鼠UUO肾脏中明显加重（约为WT小鼠UUO肾脏中Ⅰ型胶原的2倍）。以上结果表明，在Trps1单倍不足加重了由于UUO导致的肾脏纤维化程度。　　 3.Trps1表达单倍不足促进UUO肾脏纤维化过程中的TGF-beta/Smad3信号传导通路。由于TGF-beta信号通路是肾脏纤维化过程中最主要的诱导因素，所以我们检测在Trps1HT小鼠肾脏中纤维化程度加重是否与TGF-beta信号通路有关。对两种基因型小鼠的UUO纤维化肾脏进行real-timePCR和ELISA检测TGF-beta后发现，TGF-beta的mRNA和蛋白水平较阴性对照组均有显著提高。然而，两种基因型间对比发现TGF-beta水平并无显著差异。然后，我们检测了Smad3（在纤维化过程中TGF-beta的主要介导因子）的磷酸化水平(pSmad3)。对pSmad3的免疫组织化学染色发现，pSmad3的表达水平在纤维化肾脏中明显升高，并且在Trps1单倍不足的情况下pSmad3的水平更高。统计发现，在结扎后的HT肾脏中Smad3的磷酸化水平是WT的2倍以上。　　 4.肾脏纤维化程度与Trps1和Smad7蛋白水平相关。然后，我们在mRNA和蛋白水平检测了纤维化肾脏中Trps1的表达情况，以期探寻Trps1和肾脏纤维化的相关性。经过结扎的肾脏中，Trps1在mRNA和蛋白水平上均较正常肾脏低，表明Trps1表达水平与肾脏纤维化程度呈负相关。另外，我们检测了Smad7在mRNA和蛋白水平上的变化。Smad7是TGF-beta信号传导通路中的重要抑制因子。鉴于在肾脏纤维化过程中Smad2/3的高表达与Smad7水平降低有关，我们检测了在Trps1单倍不足肾脏纤维化过程中出现的Smad3磷酸化水平升高是否与Smad7水平降低有关？检测表明，在HT小鼠正常肾脏中Smad7的基础表达量就比WT小鼠正常肾脏中的Smad7表达量低。而且，在结扎后的HT肾脏中，Smad7蛋白水平继续降低，其降低幅度远高于在WT肾脏中的降低幅度。以上结果说明，Trps1的水平与纤维化程度呈负相关，并且Trps1表达量的降低导致Smad7蛋白水平的下降从而加重了肾脏纤维化的程度。　　 5.Trps1单倍不足促使了TGF-beta诱导的上皮-间叶转换(epithelial-to-mesenchymaltransition，EMT)。为了证实Trps1表达量的降低真正影响TGF-beta/Smad3信号通路，我们通过原代培养小鼠肾脏近曲小管上皮细胞(proximaltubulecells，PTCs)来检测在EMT过程中所涉及的各个因子。细胞生物学检测表明，正常和Trps1表达单倍不足小鼠肾脏上皮细胞均表现为上皮细胞特性。然而，经TGF-beta诱导后，Trps1表达单倍不足来源的PTCs(HT-PTCs)中Trps1水平下降程度更大，Smad3磷酸化程度更高，其更易被诱导成为间叶细胞。Real-timePCR和westernblot分析发现，经TGF-beta诱导后HT-PTCs中a-SMA的水平是正常PTCS的2～4倍;相反，E-cadherin的表达水平下降到正常PTCs的一半左右。并且，在HT-PTCs中Smad7蛋白的下降程度高。以上结果表明，Trps1单倍不足通过降低Smad7蛋白水平以达到增强TGF-beta/Smad3信号传导通路的目的。　　 6.Trps1单倍不足通过增加Arkadia表达以降低Smad7蛋白水平。进一步研究发现，Smad7水平降低是由于Smad7蛋白降解增加导致。我们检测了Smurf1，Smurf2和Arkadia，三个降解Smad7的E3泛素连接酶。研究发现，在Trps1单倍不足情况下Arkadia表达水平较高，是正常水平的2倍左右。以上结果表明，在EM丁过程中Trps1表达降低，导致E3泛素连接酶Arkadia表达上升，从而Smad7降解加剧，最终导致Smad7对TGF-beta/Smad3信号传导通路的抑制作用减弱，TGF-beta诱导上皮-间叶转换的能力增强，纤维化程度加重。　　 7.Arkadia基因干扰能够减轻TGF-beta诱导的EMT。应用ArkadiasiRNA干扰Arkadia的表达，我们检测了WT和HT小鼠肾小管上皮细胞经过ArkadiasiRNA处理后对TGF-beta的反应情况。经ArkaidasiRNA干扰后，WTPTCs及HTPTCs对TGF-beta的反应程度减弱，Smad7蛋白水平恢复到与WTPTCs相同，EMT过程被抑制。以上结果表明，ArkadiasiRNA处理能够通过恢复Smad7蛋白水平保护上皮细胞免受TGF-beta诱导，抑制EMT的发生。　　 [结论]　　 Trps1单倍不足通过促进Arkadia对Smad7的降解过程从而增强了TGF-beta诱导的EMT和间质纤维化程度。　　 意义:该研究通过研究Trps1在肾脏上皮细胞EMT过程中的作用机制阐明了Trps1对TGF-beta/Smad3信号通路的调控作用，为肾脏纤维化的靶向治疗，抑制/逆转EMT提供新的理论支持和实验依据。