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目的： 1.人胎盘间充质干细胞(human placenta-derived mesenchymal stem cells，hPMSCs)是移植治疗的种子细胞，但体外环境的改变影响干细胞的多种特性而限制了其应用。为寻找更合适的培养条件以进一步促进hPMSCs的优势特性，本实验模拟hPMSCs在体内的低氧微环境，探究生理性低氧培养对hPMSCs的影响。 2.更重要的，为提供相关的理论支持，本实验重点研究低氧诱导因子-2α(hypoxia-inducible factor-2 alpha，HIF-2α)对hPMSCs优势特性的调节作用，旨在揭示其中的分子机制和信号传导过程，为更好地保持hPMSCs的优势特性以提高其细胞移植的应用价值而奠定基础。 方法： 1.对比常氧(21％ O2)、低氧(5％O2)不同培养环境对hPMSCs的原始形态、细胞扩增(EdU流式细胞术检测)及EPAS1(HIF-2α)表达(qRT-PCR检测)的影响。 2.通过慢病毒过表达或shRNA沉默的方法，增强或减弱HIF-2α的作用，以研究其对hPMSCs的影响。因此将重组慢病毒:过表达HIF-2α的及其阴性对照-空载体，沉默HIF-2α的shRNA及其阴性对照shRNA，分别感染hPMSCs构建四种细胞。用共聚焦显微镜观察其形态并用流式细胞术检测其表面标志。 3.在基因、蛋白质、细胞水平上，应用qRT-PCR，WB和IF的方法，验证构建的四种hPMSCs中HIF-2α的表达情况。同样应用EdU流式细胞术检测这四种细胞的扩增率。分析HIF-2α的表达水平对hPMSCs扩增的影响。 4.研究HIF-2α对下游分子的调控以解释其对hPMSCs优势特性的调节作用机制。提取四种hPMSCs中的RNA，在分别对应的两组中通过qRT-PCR检测相关基因的相对表达量。应用WB和IF验证qRT-PCR的主要结果。 5.为验证HIF-2α调节作用的信号传导过程，应用MAPK/ERK通路的特异阻滞剂，即PD0325901，用CCK-8实验检测在通路信号阻断或空白处理下四种细胞的扩增生长情况，并用qRT-PCR检测对比下游基因的表达。 结果： 1.与常氧(21％ O2)培养相比，hPMSCs培养于低氧(5％ O2)环境中表现出更原始的形态，有更高的扩增能力并伴有EPAS1(HIF-2α)更多的表达。 2.成功构建了两组、共四种不同的细胞:过表达HIF-2α的hPMSCs（即 hPMSCs+HIF-2α)及其阴性对照hPMSCs+NC;HIF-2α沉默的hPMSCs(即hPMSCs-HIF-2α)及其阴性对照hPMSCs-NC。与未处理的hPMSCs相比，这四种细胞在形态上并无改变，且稳定表达GFP，对于间充质干细胞的典型表面标志(阳性:CD73，CD90，CD105;阴性:CD34，CD45)也保留原有的表达特点。 3.四种细胞中，在基因、蛋白质、细胞水平上，hPMSCs的扩增与HIF-2α表达高低成正相关:过表达HIF-2α的hPMSCs+HIF-2α相比其阴性对照hPMSCs+NC表达更多HIF-2α，同时其扩增率也更高。相反，沉默HIF-2α的hPMSCs-HIF-2α与其阴性对照hPMSCs-NC相比，HIF-2α表达量较低，扩增率也更低。 4.扩增相关转录因子:CCND1(CyclinD1)和MYC(c-Myc)，以及原始干细胞的主要标志:POU5F1(Oct4)，它们的mRNA相对表达量，在HIF-2α过表达的hPMSCs+HIF-2α中高于其阴性对照hPMSCs+NC。HIF-2α沉默的hPMSCs-HIF-2α相比对照hPMSCs-NC，其CCND1，MYC和POU5F1的相对表达量更低。同时，WB和IF证明了与qRT-PCR相同的结果。 5.MAPK/ERK信号通路的必要组分:KRAS，RAF1，MAP2K1，MAP2K2，MAPK3和MAPK1在hPMSCs+HIF-2α中的mRNA相对表达量高于其阴性对照hPMSCs+NC。然而，相比hPMSCs-NC，这些基因在hPMSCs-HIF-2α中表达均降低（除了RAF1改变不明显）。在这四种细胞中，低氧诱导因子的靶基因VEGFA也有上述表达趋势，但是HIF-2α的异构体:HIF-1α(HIF1A)的表达没有差别。同时，WB和IF证实了MAPK/ERK通路的效应蛋白质:p-Erk1/2有与其qRT-PCR相同的结果。 6.与空白对照处理组相比，在PD0325901(MAPK/ERK通路)阻滞处理组，hPMSCs+HIF-2α与hPMSCs+NC的扩增均降低。相似地，hPMSCs-HIF-2α和hPMSCs-NC也在PD0325901处理后扩增明显受阻。与相应的空白处理组相比，PD0325901处理的四种细胞中扩增标志CCND1和MYC均表达降低。 结论： 1.相比常规的常氧(21％ O2)环境，生理性低氧(5％O2)培养更利于人胎盘间充质干细胞的扩增生长及原始形态的保持并促进其HIF-2α(EPAS1)的表达。 2.HIF-2α通过调控CCND1(CyclinD1)和MYC(c-Myc)促进人胎盘间充质干细胞的扩增，同时通过调节POU5F1(Oct4)维持人胎盘间充质干细胞的原始干性。所以HIF-2α正向调控人胎盘间充质干细胞的扩增与干性。 3.低氧相关的HIF-2α通过MAPK/ERK通路的Ras-Raf1-Mek1/2-Erk1/2信号传导，调节CCND1和MYC基因表达促进人胎盘间充质干细胞的扩增。这一发现对于提高人胎盘间充质干细胞的优势特性在细胞移植替代治疗和再生医学中的应用价值有重要意义。