论文部分内容阅读
目的 腰椎间盘退行性变(简称退变)是引发腰背痛的主要原因，但目前腰椎间盘退变的确切机制尚不清楚。近年来有关细胞凋亡及凋亡相关基因在椎间盘退变的发生及进展中所起作用越来越受到人们重视。研究发现，细胞凋亡是退变椎间盘组织中细胞减少的主要因素，椎间盘退变与凋亡及由凋亡引起的基质代谢障碍有关。Fas基因为细胞凋亡基因，其基因产物Fas蛋白是一种细胞凋亡信号受体，当它与抗Fas单克隆抗体或Fas配体(Fas Ligand，FasL)特异性结合后，可以传导凋亡信号，诱导Fas所在细胞的凋亡。目前，Fas基因在关节软骨退变过程中所起作用的研究较多，而有关Fas基因在腰椎间盘退变过程中所起作用的研究鲜有报道，本研究应用逆转录PCR(RT-PCR)和western blot方法检测退变腰椎间盘组织中Fas、FasL的表达，通过抗Fas抗体诱导椎间盘细胞凋亡以了解Fas系统在腰椎间盘退变发生、发展中的作用。 胰岛素样生长因子-1(Insulin-like growth factor-1，IGF-1)是哺乳动物和人体中一种微量但具有多种生物学活性的多肽，在软骨形成和软骨自稳态调节中起关键作用。研究发现，IGF-1能刺激软骨细胞分裂增殖，并可延缓及阻止多种体细胞的凋亡，但有关IGF-1对人椎间盘细胞凋亡、增殖及细胞外基质代谢的影响鲜有报道。本研究主要通过体外培养人椎间盘细胞，观察不同浓度胰岛素样生长因子-1对椎间盘细胞凋亡、增殖及细胞外基质代谢的影响。 一氧化氮(Nitrix oxide，NO)是活泼的自由基分子，参与多种组织的代谢调节。研究证实，腰椎间盘突出症的患者髓核组织表达诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide sythase，iNOS)mRNA并导致NO过量释放，而过量的NO可增强胶原酶和基质金属蛋白酶(matrix metalloprotease，MMP)活性，抑制基质蛋白多糖的合成，增加Ⅱ型胶原的裂解，从而造成椎间盘的退变。因此，抑制iNOSmRNA的表达以减少NO过量释放是防治椎间盘退变潜在有效的途径。本研究通过观察一氧化氮合酶(NOS)抑制剂L—N~6—亚氨乙基一赖氨酸(L一ML)和S一甲基异硫脉(SMT)对退变椎间盘组织代谢的影响，为NOS抑制剂的临床应用提供理论依据。材料与方法 1.RT一PCR法检测退变腰椎间盘组织中Fas mRNA，FasL mRNA的表达。 2.westem blot方法检测退变腰椎间盘组织中Fas、FasL的表达。 3.倒置相差显微镜、透射电镜、Hoechst 33258荧光染色观察抗Fas抗体(CHI，，1林扩耐)处理后椎间盘髓核细胞形态学的变化。 4.DNA梯度电泳、流式细胞术、末端脱氧核昔酸转移酶(TdT)介导的dUTP缺口末端标记术(TUNEL)观察抗Fas抗体(CHll，1林岁而)处理后椎间盘髓核细胞的凋亡情况。 5.应用流式细胞术、末端脱氧核昔酸转移酶(TdT)介导的dUTP.缺口末端标记术(TUNEL)、四甲基偶氮哇蓝(M件)检测IGF一1对人椎间盘髓核细胞凋亡及分裂增殖的作用。 6.利用氯胺T法和Alcian法检测细胞培养液中经脯氨酸及硫酸软骨素的含量。 7.原位杂交检测退变腰椎间盘髓核组织iNOS mRNA和MMP3 mRNA的表达。 8.采用化学比色法检测退变腰椎间盘髓核组织NO释放量和NOS活，胜。结果 1 .Fas、FasL在退变腰椎间盘组织中的表达 RT一PCR和westem blot结果提示Fas、FasL在退变腰椎间盘组织中有过度表达，与正常腰椎间盘组织相比，其差异有显著性(P<0.05)。Fas、FaSL表达与腰椎间盘突出症分型的关系:未包含型与包含型比较，差异有显著性(P<0.05)。 2.抗Fas抗体(CHI，，1林扩而)处理后，倒置相差显微镜可见细胞密度明显降低，细胞间隙增宽，细胞缩小变圆，固缩成多个小亮点，高倍镜下见细胞内颗粒增多并可见空泡状改变。透射电镜下可见细胞表面微绒毛显著减少，核内染色质聚集成块，边集，沿核膜内侧分布，核膜褶皱内陷，胞浆空泡样变。Hoechst 33258荧光显微镜下见核内出现浓染、致密的颗粒块状荧光的凋亡细胞。 3.抗Fas抗体(CH，，，l林扩祖)处理后的椎间盘髓核细胞DNA梯度电泳可见清晰的阶梯状DNA条带。流式细胞仪分析见G，期前出现凋亡峰。TUNEL实验显示细胞核内出现棕褐色颗粒，提示为凋亡细胞。 4·IOn扩nil、IOOn岁血和1000n扩耐浓度IGF一1可抑制人椎间盘细胞凋亡，In岁dIGF一1对人椎间盘细胞凋亡无影响。 5.IGF一1从IOn留d时开始，硫酸软骨素含量、经脯氨酸含量的差异有显著性意义(P<0.01);不同浓度IGF一1组间硫酸软骨素含量、经脯氨酸含量的差异有非常显著性意义(F。二14 .13，p<0 .01;Fb=1 3 .58，P<0 .0一)。随着IGF一1浓度的增加，硫酸软骨素含量、经脯氨酸含量明显增加，IGF一1的浓度与两者呈正相关(r。=0.875，p<0.01;r、=0.912，P<0.01)。 6.10n群d和100n扩nillGF一1对人椎间盘细胞有促进增殖的作用，ln扩nil(1组)IGF一1对人椎间盘细胞的增殖无影响，而1000n岁nil(4组)IGF一1可抑制人椎间盘细胞增殖。经IGF一l(10On岁nil)处理3d后的细胞，G0/G，期细胞减少，而S期细胞明显增加，增殖指数增高，细胞增殖能力提局。 7.髓核和纤维环经过NOS抑制剂孵育后，对照?