瞬时受体电位(transient receptor potential,TRP)通道广泛分布于哺乳动物体内,是一类非选择性阳离子通道,主要介导钙离子和钠离子从细胞外进入胞质。共有七个亚家族:TRPA(ankyrin)、TRPC(canonical)、TRPM(melastatin)、TRPML(mucolipin)、TRPN(Drosophila NOMPC)、TRPP(polycystin)和TRPV(vanilloid),包含众多成员。TRP离子通道参与了一系列生理过程,包括:机械感觉、疼痛和温度感觉、味觉、维持细胞离子稳态、介导钙内流、参与调控细胞生长和调节激素分泌和神经递质释放等。现阶段的研究发现,离子通道与肿瘤的发生和发展密切相关。TRPP2离子通道又称为Polycystin-2(PKD2),最早发现于多囊肾病细胞中,与多囊肾病的发病密切相关。TRPP2主要分布在肾脏、心脏、胰腺、肠道、胆管、肾上腺、卵巢、血管平滑肌、和胎盘等组织器官,参与细胞增殖、受精过程、配偶行为及基因的不对称表达等生物学功能。但迄今为止,国内外鲜有报道TRPP2离子通道与肿瘤之间的关系。喉癌是头颈部最常见的恶性肿瘤之一,占全身恶性肿瘤的1-5%,耳鼻喉恶性肿瘤的11-22%。而且,近来有上升趋势。喉癌的病因尚不明确,吸烟、饮酒是喉癌最主要的两大外在诱因,而细胞内癌基因的激活、抑癌基因被抑制以及凋亡相关基因的失活构成发病的内因。晚期喉癌由于受限于现阶段的手术、放疗和化疗等综合治疗疗效,出现侵袭和转移,5年生存率低于50%,最终主要死于局部复发、淋巴结转移和远处转移。喉癌治疗中的最大难题是侵袭和转移,其分子机制远未阐明,针对转移的治疗手段有限。上皮间质转化是上皮源性肿瘤侵袭和转移的重要环节。目前的研究结果表明,头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)的发病与上皮间质转化密切相关。上皮间质转化发生时,在上皮标记物中,N-钙粘蛋白表达上调,紧密连接蛋白ZO-1和E-钙粘蛋白的表达下调;而间质标志物中波形蛋白表达上调;上皮间质转化相关的转录因子Snail、Twist和ZEB的表达也会上调。上皮间质转化涉及通路主要有STAT3途径、TGF-β/Smad途径、PI3K/Akt途径、Wnt/β-catenin通路、Src途径,Ras-MAPK途径和整合素信号途径等。通过以上不同通路,细胞因子作用于靶基因,使其获得侵袭、转移能力。目前明确认为转化生长因子-β(TGF-β)在肿瘤的迁移和转移中发挥作用。许多Smad蛋白(如Smad2、Smad3和Smad4)作为TGF-β细胞内天然受体,可与TGF-β结合,通过调节相关基因的转录而参与上皮间质转化。离子通道在上皮间质转化发生、发展过程中也起到重要作用。表皮生长因子(EGF)是最早在小鼠颌下腺中发现的一种蛋白质,广泛存在于人和动物体内、可促进或抑制多类细胞生长。EGF与EGFR结合后可激活体内一系列重要基因,这些基因参与调控或诱导细胞增殖以及调节细胞生长。活化的EGFR还可激活STAT3/Snail、PI3K/Akt和MAPK/Erk等信号途径引起肿瘤细胞上皮间质转化发生。EGFR在很多癌症细胞中表达升高,被认为与肿瘤细胞的侵袭和迁移关系密切。一些EGFR阻断剂已经用于癌症的治疗,特别是肺癌的治疗,取得较好的临床效果。本研究中我们分两部分探讨TRPP2对人类喉鳞状细胞癌(HLSCC)细胞上皮间质转化的影响,TRPP2调控HLSCC转移网络通路以及TRPP2对EGF介导的喉癌细胞迁移和上皮间质转化的调控作用。以明确TRPP2在HLSCC侵袭和转移中的作用及其机制,TRPP2在EGF介导的喉癌细胞迁移中的作用。为进一步阐明TRPP2的调节机制及喉癌细胞侵袭和转移的机制提供新的线索,将有助于喉癌的早期诊断和治疗以及评价预后,有助于寻找喉癌治疗的新靶点,为有效治疗喉癌提供理论和实验依据。1.TRPP2在HLSCC侵袭和转移中的作用及其机制1.TRPP2在HLSCC侵袭和转移中的作用及其机制喉鳞状细胞癌是一种上皮源性肿瘤,它的发生发展与上皮间质转化密切相关,钙离子在上皮间质转化过程中扮演着重要角色,TRPP2作为主要通透钙离子的阳离子通道,调控钙离子内流,因此TRPP2在喉癌侵袭和转移中发挥重要作用。我们通过研究喉癌手术标本,阐述了TRPP2离子通道的表达水平与肿瘤分期、病理分级及患者预后之间的关系。此外,我们还在细胞水平研究了TRPP2与人喉癌细胞株Hep2细胞的关系以及可能的调控上皮间质转化机制。得出以下结果:(1)在喉癌标本中,TRPP2的表达水平明显升高。当TRPP2的表达水平升高时,喉癌患者临床分期越晚,肿瘤细胞的分化程度越差,恶性程度越高;(2)TRPP2的表达水平越高者,患者预后越差,5年生存率越低;(3)TRPP2 si RNA转染到Hep2细胞后,显著的降低了ATP诱导的细胞内钙离子释放,并使肿瘤的迁移和侵袭出现不同程度的下降;(4)喉癌Hep2细胞在转染TRPP2 si RNA后,明显的抑制了E-钙粘蛋白、Smad4、STAT3、SNAIL、SLUG和TWIST的表达水平;而波形蛋白的表达水平升高。我们的实验数据表明,当TRPP2的表达水平增高时,可通过Smad4和STAT3通路增强上皮间质转化作用,从而加速喉鳞状细胞癌的迁移、侵袭和转移,影响患者的预后和5年生存率。2.TRPP2在EGF介导的喉癌细胞迁移中的作用EGF通过激动EGF受体(EGFR)引起STAT3/Snail、PI3K/Akt和MAPK/Erk信号通路激活,导致上皮间质转化。前部分研究证实TRPP2的表达水平增高时,可通过STAT3和Smad4通路增强上皮间质转化。在研究TRPP2与EGF介导的上皮间质转化相关性时,得到以下结果:(1)EGF作用下Hep-2细胞在转染TRPP2si RNA后,细胞迁移速率明显减慢;(2)EGF作用下Hep-2细胞转染TRPP2 si RNA后波形蛋白表达显著增强,E-钙粘蛋白表达减弱;(3)EGF作用下Hep-2细胞转染TRPP2 si RNA后Smad4表达水平减弱。这些结果提示,TRPP2离子通道被抑制后可引起EGF诱导Hep-2细胞迁移的信号通路被抑制,导致Hep-2细胞的移动能力减弱,因此,我们推测EGF介导的Hep-2细胞迁移可能受到TRPP2离子通道的调控。TRPP2可以影响Smad4依赖信号通路的活性,调控EGF介导的喉癌Hep2细胞迁移。