论文部分内容阅读
本论文围绕葡萄糖激酶(Glucokinase, GK)和线粒体两个靶标开展新型葡萄糖激酶激活剂和线粒体解偶联剂发现方面的研究工作。主要分为以下两个部分：第一部分：新型GK激活剂的设计、合成、表征及活性研究LGH00230为国家新药筛选中心(上海)李佳课题组从56000个化合物中高通量筛选得到的对GK具有中等激活活性的化合物,与常见报道的GK小分子激活剂相比,该化合物具有新颖的骨架结构。我们以LGH00230为阳性化合物,对其进行了结构改造和初步的构效关系探索。一、发展了阳性化合物LGH00230及其系列类似物的通用合成方法；进而对阳性化合物LGH00230的结构单元A进行结构改造,设计并成功合成了31个新结构化合物,利用1HNMR、13CNMR以及HRMS (ESI)等对所有化合物的结构进行了表征。所有化合物对GK激活活性的测试结果表明：当巯基上链接炔丙基(2-8)或苄基(2-12)时,化合物的活性高于阳性化合物LGH00230,特别是化合物2-8,在保持较高激活倍数(3.53)的同时,活性提高到LGH00230的3.5倍,化合物2-12的活性约为LGH00230的2倍(激活倍数3.28)；当巯基上链接氰甲基(2-9)时,化合物的活性亦稍优于LGH00230；此外,A区域的结构改造显示,保留硫醚链对化合物活性有利。二、针对阳性化合物LGH00230的结构单元B,设计、合成了三氮唑N-H键分别以炔丙基、乙酰基、甲基、氨基取代以及三氮唑与苯环之间插入亚甲基的化合物,并对化合物的结构进行了表征。这类化合物激活GK的活性测试结果显示,当化合物2-8中三氮唑N上的H分别被炔丙基(2-32)、乙酰基(2-33)、甲基(2-34)和氨基(2-35)取代后,除化合物2-33表现出微弱的活性之外,其它化合物均失去对GK的激活活性,说明该类化合物三氮唑N上的H应该被保留；在苯环和三氮唑之间插入亚甲基则使化合物失去激活GK作用,表明苯环与三氮唑直接相连形成的共轭骨架对化合物活性是重要的。三、设计、合成了38个对于阳性化合物LGH00230的C区进行结构改造的新结构化合物,利用核磁共振和高分辨质谱对所有化合物的结构进行了表征。初步的活性筛选结果表明：只改变LGH00230C区的苯环邻位醚链上烷基的长短和类型,所得化合物的GK激活活性测试结果表明,除了正己基取代化合物2-49,其它化合物都表现出程度不一的GK激活活性,并且激活倍数几乎相当;但各化合物的EC50值却有明显差异：直链烷基取代时,从甲基到正己基,随着碳链增长,化合物的EC50值由高到低,三个碳时(2-8)达到最好,接着再由低到高,直至失去活性；当取代基为异丁基时(2-51),活性较四个碳的直链烷基取代化合物(2-47)有所降低,说明苯环邻位醚链上为直链烷基时为优势结构。此外,苯环上邻位醚链(烷氧基)去除氧或以硫醚链(烷硫基)替换、苯环上取代基的变化(类型、位置、数目)以及以吡啶替换苯环的改造均使化合物失去对GK的激活活性。四、化合物2-8、2-13、2-47以及阿斯利康公司报道的化合物GKA25进行刺激胰岛素释放试验,结果显示,化合物2-8、2-13和2-47都有促进INS-1E细胞胰岛素分泌的能力,其中化合物2-8和2-13较强；化合物2-8、2-13和2-47对INS-1E细胞无毒性作用。第二部分：新型线粒体解偶联剂的设计、合成、表征及生物活性研究以课题组前期研究中发现的活性化合物AUK2029和AUK1029为结构骨架,对其进行进一步的结构改造和构-效关系分析。一、设计并成功合成了19个新结构衍生物,利用核磁共振1H、13C谱以及高分辨质谱对所有化合物的结构进行了表征。二、影响L6肌管细胞线粒体膜电位的活性检测结果表明,除个别化合物,如LBR1225温和降低线粒体膜电位外,其余化合物均在检测的起始浓度(2.5μM)下即可显著降低线粒体膜电位(与10μM CCCP降膜电位的活性相当),并且降膜电位浓度范围宽。(1)B区为酰胺键时,A区为5-甲基或4-氯取代的衍生物LBR1220、LBR1219在2.5μM浓度时降低线粒体膜电位的能力强于10μM CCCP;而A区5-位酚羟基取代(LBR1224)使得化合物在低浓度下温和降低线粒体膜电位,并呈现良好的浓度梯度依赖关系。(2)B区为酯键的衍生物中,A区邻位羟基取代并非显著改变线粒体膜电位必须的取代类型,A区邻位甲氧基、硝基取代衍生物LBR1216和LBR1217同样可以在较低浓度下显著降低L6肌管细胞的线粒体膜电位。这一结论不同于前期研究工作中AUK1029系列衍生物中获得的构-效关系。(3)A区取代基体积增大或酯基链延长均不利于显著膜电位的降低,膜电位改变温和。(4)B区由羟基替换为氨基形成的化合物降低线粒体膜电位能力显著减弱,升高浓度至10μM时方显示出明显降低线粒体膜电位的能力,同时浓度梯度依赖。(5)C区结构改造显示,5-位增加一个羟基取代基,降低线粒体膜电位的能力变得温和。三、促进L6肌管细胞葡萄糖消耗和乳酸生成的初步活性测试结果表明,LBR1216和LBR1217在5μM浓度时即呈现出与10μM Berberine几乎相当的活性结果,10μM浓度下促进葡萄糖消耗的作用强于10μM Berberine,为Berberine的1.4倍。而LBR1218, LBR1220、LBR122、 LBR1222和LBR1228在10μM浓度下促进葡萄糖消耗的作用与10μM Berberine亦相当。同时,在相同浓度下(10μM),化合物LBR1216和LBR1217显示了与Berberine相同的促进乳酸生成能力；而化合物LBR1218. LBR1220、LBR122、 LBR1222则显示了与Berberine相当的促进乳酸生成的活性,这一结果说明这些化合物具有增强糖酵解的能力。四、LBR1216和LBR1217与AUK1029在葡萄糖消耗和葡萄糖吸收方面的活性对比分析结果表明,LBR1216和LBR1217在12小时内促进葡萄糖消耗的能力与对照化合物AUK1029基本相同。10μM浓度下化合物LBR1216和LBR1217促进葡萄糖消耗的能力较强,略优于阳性化合物Berberine (10μM)。五、通过3H标记的葡萄糖吸收实验,结果显示,化合物LBR1216在2.5μM浓度时促进葡萄糖吸收的能力优于5μM浓度的Berberine。而化合物LBR1217在较低浓度(0.525μM)下即显示了与5μM Berberine相同的促进葡萄糖吸收的能力,并且在5μM浓度时达到峰值,明显强于Berberine。