基于微流控纸芯片的多标志物同时检测化学发光免疫分析技术研究

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化学发光免疫分析技术的反应过程简单且无需复杂的操作,将化学发光与免疫分析技术相结合,能够对多种生物标志物样品实现定量分析,具有线性范围宽、检测速度快、背景干扰小、回收率高等优点,因此被广泛应用于临床诊断、生化分析、环境监测等领域。微流控纸芯片可以将液体进样、化学反应、信号检测等操作集成在一起,具有制作成本低、便携、可多路分析、环境友好、生物相容性好等优点。本文开发了新型化学发光免疫分析技术,并制备了基于微流控纸芯片的多通道化学发光免疫分析装置,成功运用于对多种急性心肌梗死和癌症生物标志物的定量检测,主要研究如下:(1)制备了一种基于微流控纸芯片时间分辨型化学发光免疫分析装置,首次实现了心肌肌钙蛋白I(c Tn I)、心脏脂肪酸结合蛋白(H-FABP)以及和肽素(Copeptin)三种急性心肌梗死生物标志物的同时测定,设计了基于功能化金纳米粒子的双重信号放大化学发光免疫分析检测体系。所开发的基于金纳米材料的化学发光免疫分析技术,以一抗功能化金纳米粒子(Ab1-GNPs)作为一次信号放大探针,钴离子、二抗和鲁米诺发光试剂多功能金纳米粒(Co(II)-Ab2-luminol-GNPs)作为二次信号放大探针。通过在时间分辨型微流控纸芯片不同检测孔中依次组装Ab1-GNPs、抗原和Co(II)-Ab2-luminol-GNPs形成双抗夹心型免疫复合物。借助微流控纸芯片对化学发光共反应试剂过氧化氢的自动导流和时间可控式输运,依次激发三个检测区的化学发光反应,获得时间分辨且分离度高的化学发光信号。最后,通过读取所获得的三个化学发光发射峰的最大光强,在一次化学发光检测中实现c Tn I、H-FABP、Copeptin三种心梗生物标志物的定量分析。对c Tn I、H-FABP、Copeptin的检测范围分别为0.1 pg/m L~1μg/m L、0.5 pg/m L~1μg/m L和1 pg/m L~1 mg/m L,检出限分别为0.06 pg/m L、0.3pg/m L和0.4 pg/m L。所开发的基于微流控纸芯片的化学发光免疫分析装置具有可多元分析、灵敏度高、线性范围宽、选择性和重现性好等优点,对于早期心梗患者的疾病诊断提供了非常重要的价值。(2)开发了基于微流控纸芯片和智能手机检测的便携式化学发光免疫分析装置,设计了新型无标记多色化学发光免疫分析技术,实现癌胚抗原(CEA)、甲胎蛋白(AFP)和前列腺特异性抗原(PSA)三种癌症生物标志物的同时化学发光成像检测。首先以双层微流控纸芯片作为检测平台,将鲁米诺/荧光素/CEA抗体、鲁米诺/AFP抗体、鲁米诺/吖啶黄素/PSA抗体分别固载于微流控纸芯片的三个检测区,制备化学发光免疫分析微流控纸芯片。在相应抗原(CEA、AFP、PSA)存在下,纸芯片传感界面上的特异性识别抗体捕获对应抗原,形成免疫复合物。然后,进一步在检测区加入新型化学发光催化剂钴基金属有机框架材料ZIF-67。最后,利用双层微流控纸芯片输运共反应试剂过氧化氢并依次激发三个检测区的多色化学发光反应(CL)和化学发光共振能量转移反应(CRET),形成多色化学发光信号。以智能手机作为便携式化学发光成像信号检测设备,在拍照模式或视频拍摄模式下分别获取时空分辨化学发光成像检测图片信号和视频信号。基于传感界面上所形成的免疫复合物对ZIF-67催化剂催化性能的抑制作用,导致化学发光信号随着抗原浓度增加而降低,实现抗原的定量检测。在拍照检测模式下,CEA、AFP和PSA的检出限低至2.1 pg/m L、0.4 pg/m L和3.9 pg/m L。此外,进一步开发了智能手机应用程序(APP),应用于三种癌症标志物的智能化检测。所开发的基于智能手机检测的微流控化学发光免疫分析装置展现出良好的分析效果,具有超宽的检测范围、良好的选择性、便携性和较高的灵敏度,在癌症诊断和即时检测领域具有广阔的应用前景。
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