论文部分内容阅读
流感病毒属于正黏病毒科(Orthomyxoviridae family)流感病毒属(Influenza virus)。截止2010年4月9日,全球因禽流感病毒感染的死亡人数已达292人。虽然,迄今没有禽流感病毒在人际之间传播的报道,但是为了预防与控制未来禽流感病毒可能引起的灾害,除了更新和开发新型疫苗,研究禽流感病毒的致病机制也将在控制疾病方面发挥重要作用。目前,在抗病毒方面,研究者提出了新的防控策略：通过阻断在流感病毒感染中所必需的流感病毒与宿主的相互作用,这个方法将有效避免病毒的逃逸。鉴于此,研究流感病毒与宿主的相互作用在理解致病机制和控制疾病方面极有必要。流感病毒的NS2蛋白在各种亚型的A型病毒中都比较保守,从最初确立NS2在引导病毒核糖核蛋白(vRNP)输出细胞核的功能以来,对于NS2是否具有其它功能还未见报道。而且,NS2在vRNP出核中的作用也受到部分科学家的质疑。相对流感病毒的其它蛋白质来说,NS2的研究显得单薄。发现新的与NS2相互作用的宿主因子,在拓宽现有的流感病毒与宿主相互作用网络的同时,也可能为我们对防控流感病毒的防控打开一个新的视界。本研究以酵母双杂交为平台开展了流感病毒NS2蛋白与宿主蛋白相互作用的研究,针对NS2-CHD3的相互作用,本文试图阐述该相互作用在病毒增殖过程的意义。主要研究结果如下：1筛选与H5N1 AIV(DW株)禽流感病毒的NS2蛋白相互作用的蛋白质以NS2为诱饵从人的胎脑cDNA文库中筛选到了38个候选阳性克隆。对这38个克隆进行了回转验证以及自激活检测,表明这些克隆没有自激活现象,并且与NS2的相互作用能够在酵母中得到重现。从酵母中提取这38个克隆的质粒pGADT7-preys,扩增,测序,结果表明,其中含有7个不与AD融合。剩下的有一部分是相同克隆,因此总共获得有效克隆28个。2相互作用的验证首先对酵母双杂交获得的28个相互作用在COS1细胞中用哺乳动物双杂交进行验证,结果表明,染色质域解旋酶DNA结合蛋白3的C末端区域(C-CHD3)和热休克蛋白70结合蛋白(HSPBP1)的类似蛋白HSPBP1s(Genbank未有注册)与NS2表现出较强的相互作用。在确定NS2,C-CHD3和HSPBP1s能在哺乳动物细胞COS1中有效表达后,我们用免疫共沉淀和GST pull-down对NS2与C-CHD3和HSPBP1s的相互作用进行了验证。结果表明NS2与C-CHD3和HSPBP1s的相互作用能被这两种方法证实。通过表达NS2和C-CHD3,我们发现表达NS2导致了CHD3由细胞核重新定位到细胞质中,并且有共定位现象。另外本实验也表明病毒的感染也能改变C-CHD3的亚细胞定位,却不改变内源CHD3的亚细胞定位。3 NS2与C-CHD3和HSPBP1s相互作用的保守性考虑到NS2在A型流感病毒中具有相当的保守型,但是不同的病毒株之间还是存在少量氨酸序列差异,本文克隆了A/WSN/1933 (H1N1), A/Mexico City/001/2009(H1N1)和A/duck/Hubei/W1/2004(H9N2)的NS2,用哺乳动物双杂交表明,这些NS2虽然具有氨酸序列差异,仍然能与C-CHD3和HSPBPls相互作用。4 NS2和HSPBPls的互作结构域本文分别克隆了NS2和HSPBPls的N端结构域和C端结构域,经哺乳动物双杂交实验表明,NS2的N端结构域能与C-CHD3和HSPBPls发生相互作用。而HSPBP1s的N端结构域和C端结构域单独均不与NS2作用。另外,本文突变了NS2的核输出信号序列中三个重要的氨基酸位点(M16A,M19A,L21A),经哺乳动物双杂交实验表明这三个突变不影响其与C-CHD3和HSPBPls的相互作用。5 CHD3对病毒增殖的影响通过用绝对荧光定量PCR检测分泌到细胞培养基中的病毒含量,本研究发现表达C-CHD3在36小时能较明显的抑制病毒增殖(86倍)；进而RNAi敲除细胞内源的CHD3后,病毒在感染后36小时下降了16倍。6关于CHD3影响病毒增殖的机制探讨根据文献报道,CHD3能下调GAL4启动子调控的报告基因表达。本文利用’GAL4启动子调控的报告基因,表明NS2能拮抗内源CHD3对报告基因的下调表达,这可能是C-CHD3干扰病毒增殖的原因之一。另外,本研究发现,表达C-CHD3延迟了病毒vRNP的核输出,这可能也是C-CHD3干扰病毒增殖的原因之一。