第一部分亮氨酸重复蛋白LRRC33对TLR信号通路的调控Toll样受体是机体防御病原微生物(病毒、细胞内的细菌或寄生虫)的先天性免疫反应中的重要识别者[1]。尽管先天性免疫系统可以抵抗感染性病原体的侵袭,但是TLR信号通路的过度激活会导致过度炎症反应等严重后果。因此,抑制过度免疫反应与维持先天性免疫稳态是当今的研究热点。本部分以LRRC33作为研究对象,通过各种实验手段,阐述了其在抑制TLR信号通路活性过程中的重要作用。利用RT-PCR技术和原位杂交技术,对LRRC33的组织分布进行了检测,发现LRRC33广泛表达在机体的免疫器官中。利用NF-κB报告系统、免疫共沉淀和酶联免疫吸附技术,分析了LRRC33是否调控NF-κB转录因子的活性以及其与TLRs之间的相互作用情况,并进一步通过免疫荧光染色技术,检测了LRRC33对NF-κB亚单位p65的核转移情况的影响,探讨了LRRC33在TLR信号通路中的作用及其分子机制。构建了LRRC33的缺失片段(分别为LRRC33的胞外区、LRRC33的胞内区),分析了LRRC33的功能。最后,利用从人外周血中分离出的树突细胞,分析了沉默LRRC33对人树突细胞功能的影响。主要结果：1.通过利用分析跨膜区和基序预测的软件SMART和Pfarm,本研究鉴定出一种新的TLR同源物-LRRC33, LRRC33蛋白的细胞外区域包含17个潜在的亮氨酸重复基序,但是LRRC33蛋白的胞内区缺失了Toll/IL-1受体(TIR)区域；RT-PCR和免疫组化结果显示LRRC33广泛表达在机体的免疫器官中,尤其是在骨髓、胸腺、肝脏、肺、肠、肾脏和心脏中高表达；同时,本研究也分析了不同细胞系中LRRC33的表达情况,RT-PCR结果显示LRRC33高表达于U937细胞和从人外周血分离出的单核细胞中,但是在从单核细胞向成熟树突细胞分化的过程中,LRRC33的表达量逐渐降低。这表明LRRC33在细胞分化过程中发挥着重要作用。2.免疫共沉淀结果显示,LRRC33可以与TLR2/TLR3/TLR4/TLR9都发生相互作用。相反地,LRRC33不与MyD88发生相互作用。例如,在HEK293T细胞中,过表达LRRC33可以抑制TLR2/TLR4介导的基底水平上的NF-κB的激活；当加入PGN/LPS刺激后,LRRC33可以显著性抑制NF-κB的活性,并且大大降低了IL-8的释放。同时结果发现LRRC33可以阻碍p65的核转移过程。3.通过构建LRRC33的缺失突变体,本研究鉴定出LRRC33负责与TLRs发生相互作用的具体区域。结果显示,LRRC33的胞外区而非胞内区可以与TLR2发生相互作,并且抑制NF-κB的活性和IL-8的释放。LRRC33也可以通过抑制AP-1的活性从而阻碍JNK的激活。为进一步验证LRRC33胞外区的哪段LRRs介导了与TLRs的相互作用,本研究构建了D1(缺失1-9LRRs), D2(缺失10-14LRRs), D3(缺失15LRRs)和D4(缺失16-17LRRs).结果发现D1-D4都可以与TLR2相互结合,并且抑制NF-κB的活性和IL-8的分泌。4.沉默树突细胞中内源性表达的LRRC33会导致NF-κB的激活,并且可以显著性提高LPS刺激下TNF-a的释放,同时蛋白质免疫印迹实验结果也显示沉默LRRC33的表达可以诱导LPS介导的JNK和p38的激活。主要结论：LRRC33在维持机体先天性免疫平衡的过程中发挥广泛而且重要的作用。LRRC33能够与多个TLR相互作用,抑制TLR介导的NF-κB的激活,同时也可以抑制AP-1的激活,并降低多个细胞因子的产生,这表明了LRRC33是一个重要的炎症反应调节者。总之,本研究发现了一种可以负调控TLR信号通路的包含LRR序列的蛋白-LRRC33。这一发现对阐释TLR信号通路和炎症反应在人类发育和疾病中的功能产生了深远的意义,同时也将为治疗人类过度免疫反应提供理论基础。第二部分泛素连接酶复合体介导Smoothened泛素化的研究Hedgehog (Hh)蛋白作为一种形态发生素在形态形成和细胞生长中发挥重要作用[26]。Hh信号通路也与组织修复和干细胞维持相关。Hh信号通路的异常会导致先天性缺陷和癌症的发生[27,35]。从果蝇到哺乳动物中,Hh信号通路的传导方式是保守的。其中Patched (Ptc)是信号受体；而七跨膜蛋白Smoothened (Smo)是信号传导器,它也是Hh信号通路中的一个关键组分。在过去十几年中,科学家已经对Smo进行了广泛的研究,但是Smo的作用机理仍然存在很多疑团。研究表明Hh和磷酸化可以正调节Smo,而去泛素化和泛素化负向调节Smo[68]。最近的研究表明沉默E1泛素激活酶Ubal也可以上调Smo的蛋白水平。泛素化是蛋白质修饰的一种方式,它可以导致蛋白质降解、内吞、相互作用和运输[28,33]。本研究旨在探讨Smo泛素化的调节机制。本研究通过各种实验手段探讨了E3泛素连接酶是否参与Smo的调节过程,E3泛素连接酶怎样调节Smo的泛素化水平从而抑制其细胞表面聚集。利用RNAi筛选方法寻找Smo的E3泛素连接酶。利用RNAi干扰技术靶向了一系列待定基因；利用基因修饰筛选的方法观察了果蝇的表型特征;直接检测了S2细胞中Smo的泛素化水平。通过沉默内源性或过表达E2泛素结合酶Eff／E3泛素连接酶CG9153进一步证实了其对Smo泛素化水平的影响。通过免疫共沉淀技术检测CG9153是否通过与Smo相互作用从而调节Smo的活性。通过构建CG9153的缺失片段(包括N1、N2、HECT),检测其与Smo结合的特定位点。通过用溶酶体途径抑制剂NH4C1和蛋白酶体途径抑制剂MG132处理S2细胞,检测CG9153调节Smo的特异性。通过体内泛素化实验检测了Cullins是否参与调节了Smo的泛素化水平。最后,通过显微注射技术,检测了过表达或者沉默Ubal/Eff/CG9153/Cu14对果蝇翅盘中Smo聚集程度／蛋白水平的影响。主要结果：1. HECT家族的CG9153和Eff分别是Smo的泛素连接酶和泛素结合酶。沉默CG9153或者Eff可以下调Smo的泛素化水平,相反地,过表达CG9153可以上调Smo的泛素化水平,但是过表达Eff则不可以。这表明Eff需要CG9153才可以将泛素分子传递给底物。此外,CG9153可以与Smo相互结合,而且Hh阻碍他们之间的相互作用从而降低Smo的泛素化水平。同时,Hh可以上调CG9153的泛素化水平,揭示了阻隔泛素连接酶与其底物的相互作用促使泛素分子在连接酶上累积。2.CG9153调节Smo是通过蛋白酶体途径实现的。3.沉默果蝇体内Eff/Ubal的表达可以增加Smo和Ci在翅盘中的聚集。进一步研究发现,过表达果蝇体内的CG9153以剂量反应的趋势下调Smo在翅盘中的聚集程度。主要结论：CG9153通过与Smo相互作用调控其泛素化水平。Ubal、Eff、CG9153和Cul4形成泛素化复合体共同调节Smo的泛素化水平,四者缺一不可。总之,本研究鉴定出CG9153联合Cul4共同调节Smo的泛素化水平,为深入探讨调节Smo的分子机制提供了新的视角。