第一部分P2X7受体介导小胶质细胞活化参与慢性偏头痛中枢敏化目的目前认为中枢敏化是导致慢性偏头痛（chronic migraine,CM）发生的主要原因,而小胶质细胞活化后启动的炎症反应是介导中枢敏化形成的关键环节。研究表明P2X7受体（P2X7 receptor,P2X7R）激活后,可以促进小胶质细胞活化,导致炎症相关物质表达外释至胞外。目前尚无任何研究探索P2X7R在CM中枢敏化中的作用,以及这种作用是否与P2X7R介导的小胶质细胞功能调控有关。所以,本部分实验旨在完成以下几个目的:1.研究CM模型中,三叉神经脊束核（trigeminal nucleus caudalis,TNC）部位P2X7R的表达情况;2.探索TNC部位P2X7R对CM中枢敏化的影响;3.明确P2X7R对CM中枢敏化的影响是否与该受体调控小胶质细胞的免疫炎症功能有关;方法1.使用反复硝酸甘油（nitroglycerin,NTG）腹腔注射构建CM模型;在建模的第1天、第3天、第5天、第9天,使用免疫印迹法（Western blotting,WB）分析TNC部位P2X7R蛋白表达的时间规律;然后使用实时荧光定量PCR（real-time RT-PCR,RT-q PCR）和免疫荧光,比较正常组和模型组TNC部位P2X7R的表达情况。最后使用免疫荧光双标技术,界定TNC部位P2X7R表达的细胞类型。2.给予P2X7R拮抗剂亮蓝-G（brilliant blue G,BBG）干预,以等体积溶剂（vehicle,VEH）作为对照,将小鼠随机分为五组:SHAM组、SHAM+BBG组、NTG组、NTG+VEH组、NTG+BBG组。使用电子Von Frey测痛仪和热刺痛仪检测各组小鼠机械痛阈和热痛阈变化情况,评估中枢敏化表征—痛觉过敏的变化。使用WB和免疫荧光对各组小鼠TNC区域的中枢敏化相关生化指标—降钙素基因相关肽（calcitonin gene-related peptide,CGRP）和c-fos进行检测。3.体内实验中,给予BBG抑制P2X7R后,一方面使用免疫荧光定量分析Iba-1阳性细胞的数量和形态变化,另一方面使用WB定量分析炎症相关物质的表达变化。4.体外实验中,使用Bz ATP 0.8m M刺激BV-2细胞,模拟CM状态下TNC部位P2X7R激活,并使用WB确定P2X7R表达变化。给予BBG干预BV-2细胞,以等体积溶剂作为对照,将细胞随机分为四组:SHAM组、BBG组、Bz ATP组、Bz ATP+BBG组。使用免疫荧光技术分析各组细胞形态和i NOS表达变化,然后采取WB联合酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）的方法对细胞炎症相关物质的表达释放进行检测。结果1.WB分析提示,反复NTG给药过程中,TNC部位P2X7R蛋白表达逐渐上调,在第5天趋势显著（p<0.001）,并持续整个造模过程。从RT-q PCR和荧光层面来看,模型组P2X7R m RNA、P2X7R阳性细胞数和平均免疫荧光强度均显著升高。免疫荧光证实P2X7R在TNC区域主要分布表达在小胶质细胞上。2.行为学检测结果显示,反复NTG给药后模型组小鼠机械痛和热痛阈值均下降,表现出痛觉过敏。BBG干预可以显著改善模型鼠痛觉过敏现象。WB和免疫荧光结果显示,BBG干预可以抑制模型鼠TNC部位CGRP释放、c-fos表达,改善中枢敏化。3.体内实验中:免疫荧光结果显示,造模后TNC区域Iba-1染色阳性的细胞增多,其免疫荧光强度增加,形态上胞体变圆增大、突起缩短消失,定量分析显示细胞突起的总长度和平均长度缩短,提示小胶质细胞活化。给予BBG干预后,小胶质细胞数量及平均免疫荧光强度显著降低,细胞突起延长。此外,WB结果显示,BBG干预显著降低模型鼠炎症相关物质:NLRP3、IL-1β、IL-18表达（p<0.01）。4.体外实验中:WB结果显示,Bz ATP处理BV-2细胞后,P2X7R表达上调。这种上升趋势出现在Bz ATP处理60min,于120min达峰,可维持至180min。在免疫荧光镜下,Bz ATP处理后BV-2细胞胞体变圆增大,突起消失,i NOS表达升高。若在Bz ATP刺激前,先给予BBG预处理,细胞则表现为梭形,突起显著变长,i NOS表达降低。此外,WB联合ELISA检测到,BBG显著抑制Bz ATP诱导的BV-2细胞炎症相关物质:NLRP3、IL-1β、IL-18表达。结论CM模型中TNC部位小胶质细胞P2X7R表达上调,伴随着小胶质细胞的活化和相关炎症物质表达增加。抑制P2X7R功能可以遏制小胶质细胞激活,限制炎症反应,改善中枢敏化表征—痛觉过敏现象,抑制中枢敏化相关生化指标CGRP、c-fos表达。这些结果提示P2X7R通过介导小胶质细胞活化参与CM中枢敏化,针对该受体的干预可能为CM的防治提供新靶点。第二部分P2X7受体通过自噬介导小胶质细胞活化参与慢性偏头痛中枢敏化目的自噬水平变化可以调节小胶质细胞的活化状态,左右炎症反应的结局。既往研究提示P2X7R对自噬过程具有调控作用。但是在CM模型中,P2X7R对小胶质细胞免疫炎症功能的调控作用是否由自噬介导完成,尚无任何研究报道。此外,在CM研究领域,自噬研究仍是一片空白。因此,本部分实验旨在完成以下几个目的:1.探索CM模型小鼠TNC部位自噬活动改变;2.研究自噬活动改变对CM的中枢敏化影响;3.探索CM模型中,P2X7R是否通过自噬介导小胶质细胞激活,进而影响中枢敏化形成。方法1.反复NTG腹腔注射构建CM模型;首先使用WB技术检测正常组和模型组TNC部位自噬相关蛋白表达,然后在透射电镜（transmission electron microscope,TEM）下计数各组TNC区域小胶质细胞的自噬体,最后加用氯喹（chloroquine,CQ）干预明确CM模型中TNC部位自噬潮变化。2.给予诱导自噬药物,雷帕霉素（rapamycin,RAPA）,以等体积的溶剂（vehicle,VEH）作为对照,将小鼠随机分四组:SHAM-VEH组、SHAM-RAPA组、NTG-VEH组、NTG-RAPA组。使用电子Von Frey测痛仪和热刺痛仪检测各组小鼠机械痛阈和热痛阈变化情况,评估中枢敏化表征—痛觉过敏的变化。使用WB和免疫荧光检测各组小鼠TNC部位CGRP、c-fos表达变化,评估中枢敏化的生化改变。3.分别给予RAPA和BBG干预,使用WB技术分析自噬相关蛋白、P2X7R的表达变化。4.给予RAPA诱导自噬后,一方面使用免疫荧光定量分析Iba-1阳性细胞的数量和形态变化,另一方面使用WB定量分析NLRP3、IL-1β、IL-18的表达变化。结果1.从WB结果可以看出,造模后LC3-II表达上调、伴随p62蛋白堆积、beclin1表达无变化。模型组给予氯喹前后,LC3-II表达并无明显变化,提示CM模型TNC部位自噬潮降低。与WB结果呈现的CM高LC3-II表达一致,造模后TNC部位小胶质细胞内自噬体增多。2.行为学检测结果显示,反复NTG给药后模型组小鼠机械痛和热痛阈值均下降,表现出痛觉过敏。RAPA诱导自噬后,可以部分逆转小鼠基础疼痛阈值下降,但是对急性痛阈改变没有影响。WB和免疫荧光结果显示,RAPA干预可以抑制模型鼠TNC部位CGRP释放、c-fos表达,改善中枢敏化。3.WB结果显示,给予BBG干预后,模型鼠TNC部位LC3-II和p62表达降低;给予RAPA干预后,P2X7R表达无变化。4.免疫荧光数据显示,给予RAPA诱导自噬后,模型鼠TNC部位小胶质细胞数量及平均免疫荧光强度降低,细胞突起延长。WB结果显示,RAPA干预显著降低模型鼠NTG诱导的NLRP3、IL-1β、IL-18表达（p<0.05）。结论CM模型中TNC部位存在自噬水平抑制,激活自噬抑制小胶质细胞的激活、削弱免疫炎症反应,改善中枢敏化。P2X7R作为自噬调控的上游受体,通过自噬应答缺陷介导了小胶质细胞的活化,从而参与CM中枢敏化。自噬调节中枢敏化作为CM研究的新机制,为CM的防治提供了新靶点。