AIP1(ASK1相互作用蛋白-1)或称DAB2相互作用蛋白，是近来鉴定的Ras—GTP酶活化蛋白家族新成员，参与细胞生长抑制和细胞凋亡。然而，AIP1体内的功能研究并不清楚。本实验采用血管研究常用的动物模型观察AIP1对血管增生调控的表型，并探讨其内部的分子机制；进而，以视网膜血管发生模型研究AIP1对血管生成的影响。 第一部分AIP1作为内源性抑制因子调控VEGFR2信号介导的血管增生 目的：研究AIP1基因在体内对血管增生的调控功能及其分子机制。 方法：以AIP1基因敲除鼠(AIP1-KO)为研究对象，采用不同的实验动物模型包括小鼠后肢缺血模型及VEGF诱导的耳廓皮肤，角膜和视网膜新生血管模型观察血管增生的表型；进而，过表达AIP1研究血管表型的改变。同时，通过VEGF依赖的血管增生体外模型包括血管内皮细胞迁移和血管样结构形成实验，研究AIP1对血管内皮细胞功能的影响。此外，在分子机制研究方面，不同时间点内皮细胞VEGF处理，Westernblot检测AIP1敲除对VEGFR2信号通路(VEGFR2、PLC—γ和Akt磷酸化)的影响。免疫共沉淀分析AIP1是否直接结合于VEGFR2受体形成复合体而抑制VEGFR2信号。为研究AIP1跟VEGFR2结合的结构域，载体编码表达的全长AIP1(AIP1-F)，AIP1-N或AIP1-C与VEGFR2共表达，AIP1-VEGFR2的结合通过免疫共沉淀分析。VEGFR2与不同AIP1突变体(N，PR，PHC2)质粒共转染无内源性VEGFR2表达的293T细胞，检测不同的AIP1突变体对VEGFR2依赖的信号通路的抑制。 结果：纵观各种血管增生模型，一致的表型是AIP1-KO鼠表现出显著的血管增生，伴随异常增强的VEGF—VEGFR2信号。视网膜VEGF诱导的血管增生可以被过表达AIP1所抑制，一致的是，体外实验中内皮细胞过表达AIP1可以抑制(但敲除或沉默AIP1后增强)VEGF诱导的VEGFR2信号和内皮细胞迁移。分子机制研究表明，在VEGF反应的后期，AIP1被募集到VEGFR2-PI3K复合体，导致VEGFR2依赖的信号通路抑制。AIP1的C2结构域对VEGFR2结合极为重要。AIP1通过不同结构域，作用于VEGFR2和PI3Kp85，导致VEGFR2依赖的血管增生信号抑制。 结论：AIP1作为内源性抑制因子直接与VEGFR2结合并抑制VEGFR2介导的血管增生。 第二部分AIP1基因对小鼠视网膜血管发生的影响 目的：研究AIP1对小鼠视网膜血管发生的影响，并探讨相关的分子调控机制。 方法：观察新生AIP1-WT、AIP1-KO小鼠视网膜(代表了生理性的血管增生)以及氧诱导的视网膜血管病变(OIR)小鼠模型(代表了病理性血管增生)血管形态，研究AIP1对视网膜衄管发生的影响；进而以小鼠视网膜内皮细胞为工具研究相应的信号调控途径。 结果：在出生后早期AIP1-KO小鼠视网膜血管发育明显慢于AIP1-WT鼠。GFAP及VE-cadherin的表达也相应减弱。WesternBlot检测VEGFR2-Dll4-Notch1cleaved呈大致同向变化，即P4、P5逐渐增加，VEGFR2在P5达到峰值，但在P7Dll4表达升至峰值时VEGFR2的表达却明显下降，我们验证了高表达至一定程度的Dll4对VEGFR2有负向调控作用。进而，mRNA表达检测发现AIP1-KO鼠视网膜Notch1及其下游分子Hey1明显增加，但另一与血管增生及成熟关系密切的细胞因子PDGFBB受体PDGFRβ无显著的表达差异。因为Dll4活化可以引起血管出芽减少，血管生长缓慢，我们证实AIP1通过Notch-Dll4依赖的信号通路调控早期视网膜的血管发育。此外，从小鼠OIR模型可见，P17AIP1-KO鼠视网膜可见显著的血管出芽和分枝形成。WesternBlot分析AIP1-KO鼠视网膜的VEGFR2表达高于AIP1-WT鼠，这种高表达可以被高氧抑制。相对低氧情况下，视网膜VEGFR2重新被诱导，恢复高表达状态，在AIP1-KO鼠的增加更为显著。但是，作为血管增生的内源性抑制因子PEDF无论高氧还是相对低氧，AIP1-KO鼠的表达都高于AIP1-WT；低氧时，AIP-KO鼠PEDF的表达比常氧状态增加。说明PEDF不但拮抗低氧诱导的血管增生，而且参与拮抗AIP1依赖的VEGFR2介导的血管增生。P17时Dll4表达轻微增加但血管出芽和发生没有显著抑制，说明Notch信号在病理性血管增生并没有起主要的调控作用。 分子机制研究，AIP1-WT鼠视网膜微血管内皮细胞(MREC)VEGF处理30分钟时，Dll4表达第一次达到高峰，但随后逐渐下降，2h重新表达显著增强；Notch1的被动活化形态与Dll4完全一致。但在Dll4表达高峰时(30min、2h)，VEGFR2的表达相应减弱，说明VEGF诱导的Dll4高表达存在对VEGFR2的负向调控。值得注意的是，AIP1的表达在此时也显著增强。我们推测AIP1可能协同Dll4，共同抑制了VEGFR2活化。而在AIP1-KOMRECVEGF处理后，Dll4立即达到峰值，随后下降，在1h后重新表达显著增加。我们进一步用C57BL/6J鼠MRECVEGF处理，发现在Dll4高表达时，AIP1并不是同时高表达，而是有约15min的延迟，说明在Dll4发出负向调控信号后，AIP1才参与了抑制VEGFR2通路。 结论：AIP1作为直接结合于VEGRR2的内源性抑制因子，可以协同与血管发育密切相关的Notch信号，动态调控血管发生过程。