α-乳白蛋白(alpha lactalbumin,α-LA)是乳清蛋白中结合钙离子的主要蛋白,能提高免疫力,具有抗癌、抗微生物的功效。其所含丰富的必需氨基酸和支链氨基酸有助于促进婴儿的神经发育,已在婴儿配方食品中得到广泛应用,同时还是产乳的一个重要调节因子。人乳中α-乳白蛋白含量较高,约为4.8g/L。奶山羊是小型反刍家畜,妊娠周期短,山羊奶乳蛋白、乳脂含量高,但α-乳白蛋白含量很少。通过转基因技术在山羊乳腺中表达人α-乳白蛋白,实现羊奶人乳化,可以提高羊奶的品质,并可能提高羊奶产量。而转基因载体的构建是外源基因在乳腺中高效表达的关键技术之一。已有研究表明,以β-乳球蛋白为启动子实现了外源目的基因高效表达,复合启动子也可提高表达效率。同时,基因打靶因为可以克服随机整合的“位置效应”引起的转基因沉默,实现高效表达而成为研究的热点。因此,本研究克隆了人α-乳白蛋白第1至4外元(含内元)及部分3’调控基因组序列,将其作为目的基因,构建了不同启动子的双标记转基因载体,经过乳腺上皮细胞的表达验证其有效性后,转染奶山羊胎儿成纤维细胞(Goat fetal fibroblast cells,gFFCs),筛选得到了随机整合的转基因细胞株。在此基础上,又构建了含TK基因负筛选标记的打靶载体,转染gFFCs,筛选得到了定点整合的转基因细胞株,为制备定点修饰的转基因克隆羊提供了供核细胞。主要实验内容包括如下四部分:第一部分:人α-乳白蛋白基因乳腺特异性表达载体的构建及在乳腺上皮细胞中的表达以5.5kb的山羊βLG调控序列为启动子,hα-LA第1至4外元(含内元)及部分3’调控基因组序列为目的基因,Neo-IRES-EGFP共表达序列作为筛选标记基因,且在筛选标记两端含有两个同向的Loxp位点,1.7kb 3’βLG作为3’调控序列,依次进行表达元件、表达盒的拼接,构建成全长15.9kb的表达载体5A。在载体5A的基础上,βLG启动子后插入CMV增强子,构建成16.6kb的βLG/CMV复合启动子表达载体B9。通过酶切、PCR、测序验证了表达载体的正确性。脂质体转染法将线性化的5A、B9转染山羊乳腺上皮细胞,经G418抗性筛选9d左右,结合EGFP绿色荧光蛋白挑选出绿色荧光抗性克隆,经催乳素、胰岛素及氢化可的松诱导培养,通过RT-PCR、Western-blot检测表明,本研究构建的表达载体可在乳腺细胞中表达人α-乳白蛋白,且发现βLG/CMV复合启动子的转录活性较βLG启动子高。这为下一步制备核移植的转基因供核细胞奠定了基础。第二部分:gFFCs的分离培养与脂质体转染条件优化研究 为获得转基因克隆羊的供核细胞,采用原代组织块培养法结合胰蛋白酶消化法分离纯化gFFCs。绘制的细胞生长曲线表明该分离培养体系可以支持gFFCs良好生长,细胞生长特性符合单层贴壁细胞的增殖特征;采用SRY PCR法鉴定获得了雌性gFFCs。为获得外源基因高效转染gFFCs的方法,以GFP为报告基因,采用脂质体LipofectaminTM LTX+PLUSTMReagent介导,对转染条件进行了优化;在24孔培养板中,细胞接种6×1 04个/孔,24h后进行转染,质粒DNA0.6μg/孔,脂质体与质粒DNA比例为4.5:1,脂质体-DNA复合物与细胞作用时间为6h时,转染效率(转染后24h荧光显微镜下统计)最高,达到81.2%。第三部分:稳定整合人α-乳白蛋白基因gFFCs的建立 利用第二部分建立的脂质体介导基因转染gFFCs方法,将线性化的5A和B9载体转染gFFCs。借助于Neo和EGFP基因,经过800μg/mLG418药物筛选13-15d,分别获得G418抗性绿色荧光细胞克隆121、102个,通过96孔板-6孔板分离扩大培养,经过巢式PCR扩增鉴定,建立的细胞株皆已经稳定整合目的基因。通过EGFP报告基因的表达检测,建立的转基因细胞系荧光强度5A较B9强,生长情况与对照组比较,转基因过程没有导致细胞生长异常;冻存五个月后解冻细胞,荧光强度依然很强,且生长旺盛。这些结果表明这些阳性转基因细胞可以作为奶山羊克隆研究的供核细胞。第四部分:TK负筛选标记基因打靶载体的构建及定点整合gFFCs的筛选 以第三章构建的载体5A和B9作为骨架,5’βLG为5’同源臂,3’βLG为3’同源臂,同源臂两侧各有一个同向的HSV-TK作为负筛选标记基因,构建成以βLG为基因座的含负筛选标记的置换型打靶载体TK-5A,TK-B9,通过质粒大小、酶切、测序验证了载体构建的完整性。并对GANC的最佳筛选浓度进行确定,发现6μM GANC筛选6d效果最佳。XhoI酶切,去除原核序列,载体线性化。通过脂质体介导转染gFFCs,经1000μg/mLG418和6μM GANC筛选,得到绿色荧光抗性克隆17个TK-B9,28个TK-5A,有待进一步验证。