研究背景和目的：脑出血(Intracerebral hemorrhage, ICH)是常见的脑血管病之一,也是一种对人类健康有着严重危害的疾病,它的发病率、致残率以及死亡率都比较高。脑出血的发病是由于长期高血压导致脑内的一些细小动脉硬化引起血管破裂,进而导致脑实质内出血。脑出血在发生之后,会出现许多生理情况下不会出现的改变,给脑出血患者的预后带来很大的影响,例如脑出血之后,由于血肿的出现导致正常的脑组织和脑室系统受到压迫,会影响血脑屏障(blood-brain barrier, BBB)的正常结构引发血管渗透性的改变,还有就是在正常脑组织受压和BBB通透性改变的情况下会引发脑水肿的进展。在脑出血后的继发性损伤中,脑水肿是使脑出血患者病情恶化的主要原因之一,脑水肿的严重程度与患者的临床预后密切相关。血管源性脑水肿和细胞毒性脑水肿是脑出血后脑水肿的类型,而由BBB破坏引起的血管源性脑水肿是引起脑出血患者预后不良的主要因素。BBB是由脑的毛细血管内皮及内皮细胞间的紧密连接、内皮下基膜、周细胞、星形胶质细胞和细胞外基质形成的结构,是血液和脑组织两者之间具有防御功能的一种结构,它能够阻止血液中的一些物质进入大脑。正是通过BBB在神经系统对分子进出脑组织的严格选择,才‘能够保护脑组织免受血液内一些毒素和异常物质的破坏,为维持神经系统微环境的稳定起着重要的作用。BBB的紧密连接主要由胞质粘附蛋白和跨膜蛋白构成,胞质粘附蛋白有ZO (Zonula Occludens)-1、ZO-2和ZO-3三种亚型,跨膜蛋白主要由claudins、occludins和连接粘附分子(junction associated molecules, JAM)构成。在病理状态如脑出血的情况下,这些结构的破坏会导致BBB通透性增加。BBB的完整性破坏是脑出血后很重要的病理生理改变,而正是这种变化会促成血管性脑水肿的形成和进展,后者的出现在引起神经元非生理性死亡和神经功能紊乱中起着重要的作用。一些研究表明,一氧化氮(Nitric oxide, NO)与导致脑水肿发生的BBB破坏有着密切的关系。NO是一种内皮衍生的松弛因子,在受到类似压力、剪力、血小板凝聚等刺激的情况下会释放。在神经系统处于一些病理情况下的时候,广泛分布于其中的小胶质细胞和星形胶质细胞能够在一些刺激因子的作用下,通过大量诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)进而引起大量的NO生成。在神经系统疾病如脑缺血、脑出血和蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage, SAH)等病理性情况下,NO与BBB通透性增加有着紧密的联系。特别是在NO大量产生时,能与超氧阴离子(O2-)结合,然后形成一种叫过氧化亚硝酸盐(ONOO-)的代谢产物,它是一种强生物氧化剂,也是一种毒性和破坏性更强的产物。在ONOO-影响下,通过硝化蛋白质酪氨酸残基的途径介导自由基引起各种形式的组织损伤。也有研究发现,ONOO-的产生与脑出血后BBB的破坏程度密切相关,ONOO-能通过相关机制发挥对BBB的破坏作用,例如ONOO-能对细胞内的新陈代谢过程产生影响,能通过抑制Na+/K+泵引起细胞内外离子平衡的破坏进而诱发细胞水肿的发生和进展,另外ONOO-还能通过激活基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)来破坏BBB的完整性。而通过相应药物的干预,在抑制ONOO-生成的情况下能够有效减轻BBB的破坏程度。骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells, BMSCs),是拥有多向分化潜能并且能进行自我复制的成体干细胞。它主要来源于骨髓组织,能够进行自我更新,具有分化为骨细胞、心肌细胞、肝细胞和胶质细胞等的潜能。MSCs具有相对其它细胞来说更容易获取的渠道,也具有分离后容易传代培养的特点。而正是基于BMSCs拥有的这些优点使得它们成为研究许多疾病治疗的理想种子细胞,其中就包括应用在脑出血疾病中的治疗研究。以往的研究表明MSCs能够通过迁移到损伤部位增加内源性细胞增殖和促进血管生成等作用,达到对脑出血的治疗效果。但是近年来的一些研究表明,通过分泌多种细胞营养因子、生长因子及多种黏附分子等旁分泌作用,可能是MSCs发挥治疗效果的主要机制。随着研究的增多和深入,MSCs旁分泌作用越来越引起人们的关注。在一些组织创伤模型试验中,通过研究已经明确了MSCs的旁分泌作用对于促进组织创伤的愈合和功能的恢复具有治疗效果,其中包括心肌梗死、急性肾小管损伤、角膜损伤、肝功能损伤和颅脑外伤等实验模型。通过MSCs的旁分泌作用,可以抑制细胞的凋亡、促进创伤组织细胞的分化、诱导血管新生和减轻炎症反应等达到治疗效果。有研究发现MSCs能通过旁分泌作用促进心梗边缘区新生微血管的形成；也有研究发现通过MSCs的旁分泌作用促进脑梗塞疾病中梗死半暗区得到营养支持、抑制细胞凋亡和促进新生血管的形成；另外在MSCs的旁分泌作用下通过抗炎和免疫调节机制达到对脑损伤的相关研究也获得了证实。总而言之,目前已经有不少研究已经发现MSCs通过旁分泌机制在许多疾病中都能达到治疗效果。大量研究发现,MSCs移植能够通过促进神经细胞增殖分化、减少细胞凋亡和一定程度上减轻炎症反应达到对脑出血的治疗效果。尽管有一些实验已经通过研究发现MSCs能够通过旁分泌机制分泌一些可溶性因子,例如白细胞介素10(IL-10)、吲哚胺2,3-双加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase)和前列腺素E2(prostaglandin E2)发挥生物学特性,而且近年来一种叫肿瘤坏死因子诱导蛋白6(TNF-stimulated gene 6 protein, TSG-6)的抗炎因子在MSCs发挥作用的过程中引起越来越多的重视,但是MSCs移植能否通过旁分泌机制,减轻脑出血后BBB的破坏进而减轻脑水肿的程度,最终达到对脑出血治疗的研究却尚未见到报道。所以,本实验使用SD大鼠的脑出血模型,通过静脉移植MSCs来研究它对大鼠脑出血后血脑屏障和脑水肿的影响,探究其中可能涉及的机制,为更加全面地理解MSCs移植治疗脑出血提供更加深刻的研究基础。第一章大鼠骨髓MSCs收集、培养及细胞鉴定目的：从SD大鼠股骨和胫骨分离细胞后利用全骨髓贴壁法对骨髓MSCs进行培养最终获取作为干细胞移植的理想种子。方法：取5周大小的SD大鼠,取其股骨和胫骨,以1×106 cells/25 cm2密度接种骨髓细胞,当细胞生长至大约90%融合时消化贴壁细胞进行传代,取第3代MSCs用于本实验的研究,通过流式细胞仪对获取的MSCs进行细胞表型鉴定,相关的表型包括CD29、CD34、CD44、CD45和CD90。结果：通过流式细胞仪检测第3代MSCs结果为,CD29:99.52%, CD44: 94.63%, CD90:99.65%; CD34:1.61%, CD45:0.95%。 CD29、 CD44和CD90为高表达,CD34和CD45为低表达。结论：本实验通过全骨髓贴壁分离培养法,获得了纯度较高和生物学特性较稳定的MSCs。相关的细胞表型也符合国际上对MSCs的标准。所以我们获取的MSCs可以作为合适的种子用于本实验的干细胞移植治疗的研究。第二章BMSCs对大鼠脑出血后BBB破坏的保护作用目的：建立大鼠的脑出血模型,在不同的时间点检测与BBB破坏密切相关的物质,包括iNOS、ONOO-、MMP-9、紧密连接蛋白claudin-5和ZO-1等的表达,以及给予MSCs治疗后这些物质与神经功能的变化情况,从而为MSCs应用于临床脑出血的治疗提供新的参考依据。方法：本研究中,我们通过使用注射Ⅳ型胶原酶来建立大鼠脑出血的模型。SD大鼠被随机分为假手术组、PBS模型组(脑出血+PBS组)、MSCs移植治疗组(脑出血+MSCs组)。模型组与假手术组造模过程基本一样,唯一不同的是模型组是用10-uL的微量注射器在右侧纹状体注射含有0.5IU的Ⅳ型胶原酶2uL,而假手术组是将微量注射器刺入右侧纹状体而不注射Ⅳ型胶原酶。在大鼠脑出血造模后2h, MSCs移植治疗组通过静脉系统将经鉴定合格的浓度为5×106个/ul的200ul细胞缓慢注入,而脑出血模型组则是注射等量的200ul磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution, PBS)。我们通过免疫组织化学技术来确定Iba-1+小胶质细胞/巨噬细胞和MPO+嗜中性粒细胞的密度；通过TUNEL法检测细胞凋亡；通过ELISA法检测与炎症相关的细胞因子,包括IL-1β、IL-6、 IL-10、tumor necrosis factor (TNF)-α、interferon (IFN)-γ和transforming growth factor (TGF)-β1;通过免疫荧光技术检测与BBB破坏程度密切相关的ZO-1、iNOS和3-NT；通过WesternBlot方法检测相应蛋白表达变化,其中包括ZO-1、Claudin-5、iNOS、3-NT和MMP-9,而这些蛋白与BBB的通透性有着紧密的联系。结果：通过免疫组织化学技术法发现,在术后第3天PBS模型组较假手术组的Iba-1+小胶质细胞/巨噬细胞和MPO+嗜中性粒细胞在密度上明显增加,而MSCs移植治疗组有效地减少它们在模型组中的增加。在ELISA法检测中发现,术后第1、3和7天,与炎症相关的细胞因子也是在MSCs治疗后明显降低。免疫荧光检测结果提示在术后第3天,MSCs移植治疗组能有效增加在PBS模型组中降低的ZO-1表达量,同时降低在模型组中升高的iNOS和3-NT表达量。经过Western Blot检测同样可见,与PBS模型组中升高的iNOS、3-NT和MMP-9相比,MSCs移植治疗组在有效地降低了这几种与BBB破坏性密切相关的蛋白表达量的同时却增加了ZO-1和Claudin-5这些紧密连接蛋白的表达。结论：脑出血后相关产物的形成,对BBB的正常结构产生破坏从而增加其通透性并加重脑水肿的程度,如iNOS、3-NT和MMP-9等产物对脑血管内皮细胞紧密连接蛋白claudin-5/ZO-/1产生的破坏作用。通过静脉移植MSCs能够有效地减少上述产物的表达量从而减轻BBB的破坏程度。第三章BMSCs对大鼠脑出血后BBB保护作用的机制研究目的：目前一些研究发现MSCs移植能够对脑出血有一定的治疗效果,但是主要的机制主要是与促进神经细胞分化和诱导血管新生等相关,很少有关于MSCs作用于脑出血后BBB通透性方面的研究,而BBB通透性恰恰与脑出血后脑水肿的发生密切相关。所以我们通过建立脑出血模型,使用静脉系统移植MSCs来研究它对脑出血后BBB通透性影响的机制。方法：造模和分组与第二章“BMSCs对大鼠脑出血后BBB破坏的保护作用”采用的方法一样,通过Ⅳ型胶原酶建立大鼠脑出血的模型,并将SD大鼠随机分为假手术组、PBS脑出血模型组、MSCs移植治疗组。通过mNSS评分系统,评估脑出血后1和3天大鼠的神经运动功能情况。用脑水含量和伊文斯兰(Evan’s blue, EB)检测的方法,评估脑出血后1和3天大鼠的脑水肿和BBB破坏程度。通过RT-PCR技术检测免疫抑制相关抗炎因子TSG-6的表达情况,而WesternBlot技术除TSG-6之外,也对NF-κB信号通路进行检测。结果：通过mNSS评分系统和对大鼠脑水含量以及EB检测的方法,我们发现：与假手术组相比,在脑出血后的1和3天,PBS模型组的大鼠mNSS评分升高,BBB通透性以及脑水肿的程度明显增加。而在MSCs治疗组,mNSS评分得到下降,BBB通透性和脑水肿的程度也有不同程度的改善。不管是RT-PCR还是Western Blot技术都发现,相对假手术组和PBS模型组,TSG-6的表达量在MSCs治疗组显著增加,而通过Western Blot对NF-κB信号通路的检测发现,MSCs能够抑制IκBs在模型组降低的趋势,相反却能抑制胞质中p65 Ser536和胞核中NF-κB p65这两种蛋白在PBS模型组升高的趋势。结论：在脑出血模型中,MSCs具有增加血管内皮细胞紧密连接蛋白、降低BBB通透性以及脑水肿程度的作用。这一现象可能是通过MSCs的旁分泌机制增加TSG-6蛋白的表达量,从而抑制NF-κB信号通路,进而减少能够引起BBB通透性增加的iNOS以及3-NT的表达量,最终对脑出血后脑水肿的程度具有缓解作用。