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空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni, C. jejuni)是一种重要的食源性感染病原菌。全球范围内,空肠弯曲菌感染是急性胃肠炎最常见的病因之一,其严重的并发症为Guillain-Barré和Miller-Fischer综合症。随着日益严重的多重耐药现象的出现,C. jejuni感染的控制和治疗受到严峻的考验,迫切需要寻找新的途径来控制这类致病菌的感染。铁对于细菌的生长是至关重要的,尽管地球上有着非常丰富的铁元素,但是对于致病菌来说铁的生物利用度却相当低。对C. jejuni来说,来自宿主红细胞裂解的血红蛋白血红素(heme)是其铁的主要来源。而血红素氧合酶ChuZ在降解血红素并获取铁的机制中起到非常重要的作用。本研究拟解析ChuZ的晶体结构,从分子水平阐明C. jejuni利用铁元素的机制,从而为以ChuZ为靶点,通过阻断C. jejuni对铁元素的摄取,开发抗C. jejuni感染的的新型药物提供理论依据。方法:1.chuZ基因克隆及重组ChuZ蛋白的制备。以C. jejuni(NCTC11168)全基因组为模板,PCR扩增chuZ基因并构建到原核表达载体pET22b上,采用E. coli BL21工程菌表达ChuZ蛋白。依次采用亲和层析、分子筛层析和离子交换层析方法纯化得到高质量的ChuZ蛋白。2.ChuZ结晶条件搜索。采用Hampton Research公司的72孔板(HR3-086)和晶体初筛试剂盒Index、crystal screen HR110、SaltRx和PEG/ion等,通过Mircobatch法进行初步的结晶条件筛选,在得到初步结晶条件的基础上,对结晶条件进行优化获得最终的结晶条件。3.晶体数据收集处理和结构解析。X-射线晶体衍射方法收集到ChuZ-hemin的衍射数据,采用分子置换法以已有结构(3GAS)为模型获得相位并解析得到ChuZ-hemin复合物的晶体结构,并对最终模型进行分析。4.酶活相关关键残基功能分析。在结构分析的基础上,制备参与结合底物血红素的相关残基突变体,对参与结合底物血红素的相关残基进行突变,检测突变体的酶学活性并与野生型ChuZ活性相比较,验证和评价ChuZ酶活的关键残基。5.表面独特的血红素结合位点的分析。分别用紫外分光光度法和ITC法测量ChuZ蛋白及其突变体与血红素的结合常数和结合比例。6.突变体晶体结构分析。制备参与结合底物血红素的相关残基突变体蛋白,结合hemin后采用制备ChuZ晶体同样方法、收集衍射数据并解析突变体蛋白的晶体结构。结果:1.成功构建了表达ChuZ蛋白的重组质粒pET22b-chuZ,并实现了其以可溶形式表达。经多种层析方法的联合应用后,纯化得到了高纯度的ChuZ蛋白,蛋白纯度达到95%以上。2.以出现针状晶体条件优化,最终晶体生长条件为:蛋白浓度168mg/ml,microbatch板生长,池液条件:0.1M MES 23%PEG400 50mM pH6.5 iminazole 50mM ammonium tartrate ,蛋白与池液1:1混合放置3天后即出现红色棍状晶体,七天后晶体大小为0.1×0.1×0.7 mm3。3.运用X-射线晶体衍射法收集了一套2.4?分辨率的ChuZ-hemin数据,数据处理结果:空间群C2221,晶胞参数a = 106.474, b = 106.698,c = 52.464 ?,α=β=γ=90°。运用PHASER程序以HugZ(PDB ID 3GAS)为模型,采用分子置换法解析了ChuZ的三维结构,该结构采用split-barrel折叠方式,明显不同于经典的全α螺旋的单体血红素氧合酶的结构。明确了参与底物结合的关键残基如R166、H9和H14。4.成功构建了R166A、H245Q/R166A、H245Q/H9A/H14A、R166A/H9A/H14A、H9A/H14A突变体,通过酶活实验明确了R166A/H9A/H14A完全丧失了酶的活性。5.紫外吸光度值测定结果表明:H9A/H14A的ChuZ突变体结合一个hemin,野生型ChuZ结合1.5个hemin。ITC结果表明H9A/H14A突变体和wild-type ChuZ的结合常数与其它细菌的HO基本一致,结合比例与紫外结果和晶体结构中一致。6.获得了H9A/H14A突变体的晶体,并收集得到一套3?的数据,电子密度图显示,其表面血红素结合位点没有血红素的残余密度,提示该突变体丧失了结合血红素的能力。结论:ChuZ的三维结构采取独特的split-barrel折叠方式,与大多数获得结构解析的全α螺旋的单体血红素氧合酶的结构明显不同,属于一个以HugZ为代表的新的血红素氧合酶家族。ChuZ在溶液和晶体中以同源二聚体存在。在ChuZ的精细结构中发现一个新的血红素结合位点,它与普遍存在于血红素蛋白中的“经典位点”不同,位于分子表面通过水分子介导的四个组氨酸结合血红素,这样的结合方式在其他血红素氧合酶中尚未发现过。定点突变研究证实了ChuZ是新一类血红素结合蛋白家族的特殊成员,并通过对ChuZ的结构-功能关系分析以及与同源蛋白的对比研究,发现C端结构域的血红素结合“口袋”是ChuZ酶催化机制的关键结构基础。