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卵巢疾病是导致奶牛繁殖障碍的重要原因之一。深入探讨奶牛卵巢生理功能和发病学机制,可为奶牛卵巢疾病更加合理治疗方案的制定和靶向治疗药物的筛选提供科学依据。大量研究证明,哺乳动物排卵过程类似于炎症,先天免疫在其中发挥着重要作用。TLRs是动物先天免疫系统中一类具有重要功能的PRRs,已被证明存在于多种哺乳动物卵巢组织,在卵巢生理活动和卵巢相关疾病发生发展过程中发挥重要作用。随着人们对TLRs在卵巢先天免疫研究方面的深入,TLR2/4的内源性配体HMGB1在卵泡液中的作用引起了研究者的兴趣。但是到目前为止,HMGB1和TLRs在卵巢活动及相关卵巢疾病中的功能还不甚明确,其在奶牛卵巢颗粒细胞中的作用研究报道较少。本论文以原代奶牛卵巢颗粒细胞为对象,采用qRT-PCR、免疫印迹、免疫组化、免疫共沉淀、间接免疫荧光、ELISA和基因沉默等技术,研究了HMGB1和TLR2在不同发育阶段卵泡来源的颗粒细胞中的表达规律及调控其表达的因素,分析了HMGB1/TLR2对排卵相关基因的影响及姜黄素通过HMGB1/TLR2/NF-κB对排卵相关基因的干预作用。结果表明:来源于不同发育阶段的健康卵泡颗粒细胞均可高表达TLR3、TLR1、TLR6、TLR2、TLR10和HMGB1,低表达TLR4和TLR5,不表达TLR7/8/9,TLRs和HMGB1的表达水平随着卵泡的发育呈逐渐升高趋势;TLR2分别与HMGB1、TLR1和TLR6之间存在交叉对话,这种对话也会随着卵泡的发育呈增强趋势;用5种浓度的FSH刺激卵巢颗粒细胞6 hr,其中12.5、25、50 mIU/mL FSH不会抑制细胞活性,25和50 mIU/mL FSH能显著上调HMGB1、TLR2、TLR1、TLR6和MyD88的表达水平,12.5、100和500 mIU/mL FSH对这些蛋白的调节作用不明显。在细胞培养液中加入0.2、1和5μg/mL HMGB1孵育6 hr后,5μg/mL HMGB1能显著上调卵巢颗粒细胞内TLR2、EGFR、VEGF、StAR、TIMP1/2的mRNA水平与TLR2、TLR1、TLR6、p-NF-κB p65蛋白水平,引起细胞NF-κB p65发生核易位和大量分泌IL-6;HMGB1分别与TLR2、TLR1、TLR6和p-NF-κB p65之间存在交叉对话,对话强度与HMGB1有剂量依赖性,siRNA靶向基因沉默TLR2能显著逆转HMGB1引起的上述变化。分别用1.25、2.5和5μg/mL姜黄素预孵育卵巢颗粒细胞6 hr,再用5μg/mL HMGB1孵育卵巢颗粒细胞6 hr后,5μg/mL姜黄素能显著下调HMGB1引起的TLR2与排卵相关基因的mRNA水平变化、显著下调TLR2、TLR1、TLR6和p-NF-κB p65蛋白水平、抑制NF-κB p65的核易位和IL-6的分泌,降低HMGB1与TLR2、TLR1、TLR6和p-NF-κB p65的交叉对话。综上所述,奶牛不同发育阶段的卵泡颗粒细胞能表达TLRs家族成员和HMGB1,表达水平与卵泡发育程度有相关性;FSH对卵巢颗粒细胞HMGB1和TLR2的表达有一定调控作用;HMGB1能通过TLR2激活颗粒细胞中的NF-κB信号通路,刺激细胞大量分泌IL-6,进而影响排卵相关基因表达;姜黄素干预能显著逆转HMGB1对TLR2/NF-κB的激活,抑制IL-6的分泌,影响排卵相关基因的表达。HMGB1可以作为评估卵泡发育程度的指示性指标及治疗卵巢相关疾病的潜在性靶点,但仍需深入研究。