论文部分内容阅读
第一部分脓毒症致急性肾损伤小鼠模型的构建及胰岛素样生长因子结合蛋白7和金属蛋白酶组织抑制蛋白-2的表达目的:构建小鼠脓毒症致急性肾损伤模型,并通过肾组织病理学评分、酶联免疫吸附(ELISA)、蛋白免疫印迹(Western blot)等分子生物学方法检测血清中炎症因子、肾组织中周期相关蛋白和凋亡相关蛋白、肾组织和尿液中IGFBP7和TIMP-2的差异性表达。方法:选取6-8周龄、体重20-25克的SPF级雄性C57BL/6小鼠36只,随机分为假手术(sham)组和盲肠结扎穿孔组(CLP)组,各组又分为3个亚组(6h,12h,24h)。sham组只进行开腹后关腹,CLP组50%盲肠结扎穿孔。各组于预设时间点收集尿液经ELISA测定IGFBP7和TIMP-2水平。麻醉后左心穿刺采血,经ELISA测定血浆中TNF-α和IL-6水平。取肾组织,行组织病理学评分并用Western blot检测肾组织中周期相关蛋白cyclin D和cyclin E、凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax表达,用RT-PCR和Western blot检测肾组织中IGFBP7和TIMP-2的表达。结果:1.血浆炎症因子比较与假手术组相比,CLP术后6小时TNF-a和IL-6水平开始升高,术后12小时TNF-a和IL-6水平最高。2.肾脏病理及病理评分比较假手术组肾组织无明显变化,CLP组小鼠有肾小管上皮肿胀、刷状缘缺失、空泡变性、小管坏死、管型形成。与sham组相比,CLP组小鼠肾组织病理评分明显增加。小鼠肾组织病理学评分随着CLP术后时间的增加而增加。3.周期相关蛋白cyclin D和cyclin E以及凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax表达相较于sham组,CLP组小鼠肾组织中cyclin D和cyclin E的表达以及Bcl-2/Bax值随着CLP术后时间的增加而下降。4.肾组织中和尿液中IGFBP7和TIMP-2的水平sham与假手术组相比,CLP组尿中IGFBP7和TIMP-2明显升高,术后12小时尿IGFBP7和TIMP-2水平最高。sham组和CLP组在6h和12h时肾组织IGFBP-7差异无统计学意义(p>0.05);24h时CLP组IGFBP7表达较sham组明显降低。与sham组相比,6h和12h时肾组织TIMP-2蛋白水平增加;24h时sham组和CLP组TIMP-2差异无统计学意义(p>0.05)。与sham组相比,CLP组肾组织IGFBP-7和TIMP-2m RNA水平明显上调。结论:1.50%盲肠结扎穿孔可很好的复制脓毒症致肾损伤且不容易造成动物死亡。2.小鼠发生脓毒症致肾损伤后肾组织发生G1/S期阻滞并导致小鼠肾脏组织发生凋亡。3.小鼠发生脓毒症致肾损伤后尿液中IGFBP7和TIMP-2水平明显增加,且这种增加与肾脏合成IGFBP7和TIMP-2增加有关。第二部分脂多糖诱导IGFBP7和TIMP-2沉默后TCMK-1细胞炎症反应模型的构建以及IGFBP7和TIMP-2对脂多糖诱导的TCMK-1细胞炎症因子、细胞周期、凋亡和自噬的影响目的:构建脂多糖诱导IGFBP7和TIMP-2沉默后TCMK-1细胞炎症损伤模型,探索IGFBP7和TIMP-2对脂多糖诱导的TCMK-1细胞炎症因子、细胞周期、凋亡和自噬的影响。方法:使用浓度依次为0μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、500μg/m L的LPS分别处理6、12和24小时。各组于预定时间点收集吸去培养基经ELISA检测细胞炎症因子,收集细胞后经Western blot检测周期相关蛋白cyclin D、cyclin E和p-RB水平。将细胞分为Con组、LPS组、NC组、LPS+IGFBP7 si RNA和LPS+TIMP-2 si RNA组,使用Lipo3000对细胞进行转染,待细胞长满后,LPS组、NC组、LPS+IGFBP7 si RNA和LPS+TIMP-2 si RNA组均加入浓度为1mg/ml的LPS母液400μl,使得LPS终浓度为200μg/ml,6小时后收集细胞和培养基,使用ELISA检测细胞炎症因子,使用Western blot检测IGFBP7和TIMP-2、周期相关蛋白cyclin D、cyclin E和p-RB、凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax以及自噬相关蛋白LC 3b和p62水平。结果:1.LPS对培养基中炎症因子浓度以及TCMK-1细胞周期相关蛋白cyclin D、cyclin E和p-RB水平的影响使用LPS处理12小时和24小时后发现,各浓度梯度炎症因子浓度和cyclin D、cyclin E和p-RB水平之间差异无统计学意义(p>0.05);使用LPS处理6小时后,炎症因子浓度随LPS浓度的增加而增加,且cyclin D、cyclin E和p-RB水平随LPS浓度的增加而降低。2.si IGFBP7和si TIMP-2对目的蛋白的沉默效率使用si RNA转染发现,NC组与对照组中目的蛋白的表达差异无统计学意义(p>0.05)。与对照组相比,si IGFBP7和si TIMP-2中各序列均可导致TCMK-1细胞中目的蛋白的表达下降。其中,与对照组相比,I3组和T3组目的蛋白表达度最低(p均<0.001)。沉默效率最低可分别达到69.8%和79.7%。因此,本研究将选取I3组和T3组使用的si RNA IGFBP7-953和si RNA TIMP-2-884两个序列进行下一步研究3.IGFBP7和TIMP-2对培养基中炎症因子浓度的影响与Con组相比,LPS组和NC组炎症因子明显增加;LPS组和NC组之间炎症因子浓度差异无统计学意义(p>0.05);LPS+IGFBP7 si RNA和LPS+TIMP-2 si RNA组炎症因子浓度较NC组明显降低。4.IGFBP7和TIMP-2对细胞周期相关蛋白cyclin D、cyclin E和p-RB水平的影响与Con组相比,LPS组和NC组cyclin D、cyclin E和p-RB水平明显降低;LPS组和NC组之间cyclin D、cyclin E和p-RB水平差异无统计学意义(p>0.05);、LPS+IGFBP7 si RNA和LPS+TIMP-2 si RNA组cyclin D、cyclin E和p-RB水平较NC组明显增加。5.IGFBP7和TIMP-2对细胞凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax水平的影响与Con组相比,LPS组和NC组Bcl-2/Bax值明显降低;LPS组和NC组之间Bcl-2/Bax值差异无统计学意义(p>0.05);LPS+IGFBP7 si RNA和LPS+TIMP-2 si RNA组Bcl-2/Bax值较NC组明显增加。6.IGFBP7和TIMP-2对细胞LC 3b和p62水平的影响与Con组相比,LPS组和NC组LC 3bⅡ/Ⅰ值明显降低,p62水平明显升高;LPS组和NC组之间LC 3bⅡ/Ⅰ值及p62水平差异无统计学意义(p>0.05);LPS+IGFBP7si RNA和LPS+TIMP-2 si RNA组LC 3bⅡ/Ⅰ值较NC组明显增加,p62水平明显降低。结论:1.LPS处理6小时可呈剂量依赖性诱导TCMK-1细胞的炎症反应和G1/S周期阻滞。2.IGFBP7和TIMP-2沉默后可显著缓解因LPS导致的G1/S期阻滞和炎症反应,并减轻因LPS导致的细胞凋亡水平和自噬水平的增加。第三部分IGFBP7和TIMP-2对脂多糖诱导TCMK-1细胞炎症损伤的可能机制目的:构建脂多糖诱导瑞博西林预处理后IGFBP7和TIMP-2沉默的TCMK-1细胞的模型,进一步探讨细胞周期在IGFBP7和TIMP-2在脓毒症致AKI中发挥的作用。通过检测ERK1/2、JNK、p38、AKT和m TOR的水平,进一步判断IGFBP7和TIMP-2在脓毒症致AKI中的可能机制。方法:使用浓度依次为0、100n M、500n M、1μM、2μM、5μM、10μM的瑞博西林处理细胞,24小时后收集细胞,经Western blot检测p-RB、Bcl-2和Bax水平。将细胞分为con组、NC、si IGFBP7组、si TIMP-2组、si IGFBP7+R组和si TIMP-2+R组,使用Lipo3000对NC、si IGFBP7组、si TIMP-2组、si IGFBP7+R组和si TIMP-2+R组细胞进行转染,细胞融合度为80%左右时,si IGFBP7+R组和si TIMP-2+R组分别使用工作浓度为5μM的瑞博西林处理18小时后更换为瑞博西林浓度为5μM、LPS浓度为200μg/ml的培养基联合处理6小时,NC组、si IGFBP7组和si TIMP-2组使用浓度为200μg/ml的LPS处理6小时。各组于预设时间点收集细胞,使用Western blot检测p-RB、凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax以及ERK1/2、JNK、p38、AKT和m TOR的水平。结果:1.瑞博西林对TCMK-1细胞p-RB、Bcl-2和Bax水平的影响与对照组相比,瑞博西林处理24小时后,p-RB水平随着瑞博西林剂量增加而降低;各浓度梯度之间Bcl-2/Bax水平差异无统计学意义(p>0.05)。2.瑞博西林预处理对脂多糖诱导IGFBP7和TIMP-2沉默后TCMK-1细胞p-RB水平以及Bcl-2/Bax值的影响与con组相比,NC组p-RB水平显著降低,Bcl-2/Bax值显著降低;与NC组相比,si IGFBP7组和si TIMP-2组p-RB水平以及Bcl-2/Bax值显著增加;si IGFBP7+R组和si TIMP-2+R组分别与si IGFBP7组和si TIMP-2组相比,p-RB水平明显降低,Bcl-2/Bax值差异无统计学意义(p>0.05)。3.瑞博西林预处理对脂多糖诱导IGFBP7和TIMP-2沉默后TCMK-1细胞LC 3b和p62水平的影响与con组相比,NC组LC 3bⅡ/Ⅰ值显著降低,p62水平显著增加;与NC组相比,si IGFBP7组和si TIMP-2组LC 3bⅡ/Ⅰ值明显增加,p62水平显著降低;si IGFBP7+R组和si TIMP-2+R组分别与si IGFBP7组和si TIMP-2组相比,LC 3bⅡ/Ⅰ值明显升高,p62水平明显降低。4 IGFBP7和TIMP-2对LPS诱导的产生炎症反应的TCMK-1细胞AKT/m TOR和MAPK通路的影响与对照组相比,LPS组和NC组p-38、p-JNK、p-ERK1/2和p-AKT水平明显增加;LPS组和NC组之间p-38、p-JNK、p-ERK1/2和p-AKT水平差异无统计学意义(p>0.05);与NC组相比,LPS+IGFBP7 si RNA和LPS+TIMP-2 si RNA组p-38、p-JNK、p-ERK1/2和p-AKT显著增加。结论:1.瑞博西林可呈剂量依赖性诱导TCMK-1细胞发生G1/S周期阻滞,且不诱导细胞凋亡。2.IGFBP7和TIMP-2沉默后降低LPS致细胞凋亡的作用不依赖于细胞周期阻滞。3.瑞博西林可进一步增加IGFBP7和TIMP-2沉默后细胞的自噬水平。4.IGFBP7和TIMP-2沉默后可通过抑制MAPK和AKT/m TOR通路的激活减轻TCMK-1细胞的炎症性损伤。