溃疡性结肠炎不同疾病阶段寒热证分布规律及其分子机制的实验研究

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目的探讨溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)活动期和缓解期寒热证候分布规律及UC不同阶段温度受体TRPs表达特征与中医寒热证型之间的可能联系。方法1、通过计算机检索近10年来中国知网(CNKI)、万方数据知识平台、维普数据库(VIP)、PubMed、Web of Science上有关UC中医临床研究的文献报道,经诊断标准、纳入及排除标准筛选后,选择符合本研究的文献资料,采用数理统计的方法,对中医药治疗活动期和缓解期UC的临床研究文献进行证型分布情况的统计和评价,从而得出UC的中医证型分布情况。2、在第一部分文献研究结论的基础上,开展第二部分动物实验研究。使用葡聚糖硫酸钠(dextran sodium sulfate,DSS)溶液自由饮用法制备经典大鼠UC模型,对照组自由饮用蒸馏水代替DSS溶液造模。两组均按照造模前1天、造模后第10、17、24天收集大鼠结肠组织。记录大鼠外观、活动能力、食欲、大便等一般生命情况,观察和检测各温度受体(TRPV1、TRPV2、TRPV3、TRPV4、TRPA1、TRPM8)在结肠组织的免疫组化染色情况,常规行肠道病理炎症活动程度评分(Geboes评分),综合大鼠一般表现及结肠大体表现,明确大鼠UC模型对应的炎症早期、炎症后期、缓解期及愈合期节点。并在此基础上通过免疫组化染色测定结肠组织不同种类温度受体在不同疾病阶段的空间分布、蛋白表达量上的特征。结果第一部分:1、经统计,共纳入224篇文献,涉及15304例病例,含兼夹证、复合证型共有42种证型,拆分兼夹证、复合证并统一命名后,共得到25种证型。2、在所有纳入的25种证型中,按各证型在224篇文献中出现频次由高到低依次排序,前3位证型分别为大肠湿热、湿热内蕴和脾肾阳虚证,其中活动期大肠湿热、湿热内蕴证出现频次最高,两者占比51.42%;缓解期脾肾阳虚证出现频次最高,在缓解期所有文献中出现频次占比达50%。按各证型出现病例数量由高到低依次排序,前5位的证型依次为大肠湿热、湿热内蕴、脾肾阳虚、脾虚湿热和脾虚湿蕴证;活动期证型分布以大肠湿热型排第一位,病位证素按例数由多到少依次为:脾>大肠>肾>肝>胃>肠络,病性证素按例数由多到少依次为:湿>热>气虚>阳虚>瘀>气郁(滞)>寒>毒>阴虚>血虚;缓解期证型分布以脾肾阳虚为主,病位证素按例数由多到少依次为:脾>肾>肺>胃>肝,病性证素按例数由多到少依次为:阳虚>气虚>湿>热>毒>瘀>气郁。第二部分:大鼠自由饮用4.5%DSS溶液10天可以成功造模UC疾病活动期;给予1%DSS溶液继续维持自由饮用7天,大鼠结肠组织病理形态符合UC炎症后期表现(黏膜层虽有UC典型表现,炎性细胞浸润却较前减少);4.5%DSS溶液10天+1%DSS溶液7天+蒸馏水7天自由饮用可成功造模大鼠UC缓解期病理模型。通过免疫组化分析测定UC大鼠结肠组织中6种温度受体(TRPV1、TRPV2、TRPV3、TRPV4、TRPA1和TRPM8)的表达水平及空间分布,证实了结肠组织各层均有6种温度受体的分布,以刷状缘、结肠上皮细胞、杯状细胞、固有层间质细胞及神经节表达较多。6种温度受体表达量上变化:TRPV1:基线与对照组各检测点之间无显著统计学差异(P>0.05):各节点模型组与相应对照组相比,D10模型组略低于对照组(P>0.05),D17模型组明显低于对照组(P0.05);D10、D17、D24各节点模型组比较差异有统计学意义(P0.05);D10、D17、D24各节点模型组表达值呈上升的趋势,然三者比较差异无统计学意义(P>0.05)。TRPA1:基线与对照组各检测点之间存在统计学差异(P0.05);D24模型组明显下调(P0.05)。结论1、UC活动期、缓解期分别以大肠湿热、脾肾阳虚为主要证型,具有不同疾病阶段寒热证转换的特点。随着UC辨证阶段转化,温度受体表达出现规律性趋势变化,在大肠湿热阶段(D10-D17),TRPV1、TRPV2、TRPA1、TRPM8 表达下调,而 TRPV3、TRPV4表达上调;在脾肾阳虚阶段(D17-D24),各温度受体表达呈上调趋势。温度受体的表达特征可能与UC疾病的寒热证转换具有一定相关性,而对于温度受体的表达变化究竟是寒热证的结果还是原因,仍有待进一步研究。2、DSS造模法具有较好的剂量-时间-病理相关性,较为适合进行与UC分期有关的中医药研究。
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