一、目的:肺癌发病率逐年上升,致死率居高不下,已经成为严重威胁人类健康的杀手之一。顺铂是目前治疗肺癌的一线药物之一,但是其在治疗过程中会逐渐产生耐药性,这成为影响肺癌治疗效果的重要因素。研究表明顺铂在治疗肺癌过程中会诱导肺癌细胞产生自噬活性,这是产生顺铂耐药的关键机制之一,因此抑制自噬就成为增效顺铂对肺癌治疗效果的有前景的策略之一。在本研究中,我们拟通过体内外实验对中药小分子蝙蝠葛苏林碱抑制自噬的效果和机制以及增效顺铂治疗肺癌的效果和机制进行深入的探索和研究。二、方法:(1)蝙蝠葛苏林碱对肺癌细胞自噬的影响1、通过免疫荧光染色标记自噬体,检测蝙蝠葛苏林碱作用后肺癌细胞中自噬体数量的变化。2、通过Western blot实验检测蝙蝠葛苏林碱作用后肺癌细胞中自噬相关指标p62和LC3蛋白水平的变化。3、通过mCherry-GFP-LC3质粒转染实验检测蝙蝠葛苏林碱作用后肺癌细胞中自噬流的变化。(2)蝙蝠葛苏林碱抑制肺癌细胞晚期自噬流的机制研究1、构建稳定表达GFP-LC3的A549肺癌细胞稳定株,结合LysoBrite染料标记溶酶体,通过红绿荧光的共定位情况来检测蝙蝠葛苏林碱是否影响肺癌细胞中自噬体和溶酶体的共定位。2、LysoTraker实验检测蝙蝠葛苏林碱对肺癌细胞溶酶体酸化的影响。3、吖啶橙染色实验检测蝙蝠葛苏林碱对肺癌细胞溶酶体酸化的影响。4、Western blot实验检测蝙蝠葛苏林碱对肺癌细胞溶酶体水解酶的影响。(3)蝙蝠葛苏林碱抑制肺癌细胞溶酶体酸化的机制研究1、转录组学测序检测蝙蝠葛苏林碱作用后肺癌细胞基因转录水平的变化。2、Western blot实验检测钙拮抗剂对蝙蝠葛苏林碱引起的抑制自噬相关蛋白指标变化的影响。3、LysoTraker实验检测钙拮抗剂对蝙蝠葛苏林碱引起的溶酶体酸化抑制的影响。4、Fluo 4-AM钙离子绿色荧光探针染色实验检测蝙蝠葛苏林碱对肺癌细胞内钙信号的影响。5、siRNA转染实验检测ITPR2和TPC2在蝙蝠葛苏林碱引起的钙离子升高中是否起重要作用。6、siRNA转染实验及LysoTraker实验检测ITPR2和TPC2在蝙蝠葛苏林碱引起的溶酶体酸化抑制中是否起重要作用。(4)蝙蝠葛苏林碱增效顺铂杀伤肺癌细胞的效果研究1、CCK8实验检测蝙蝠葛苏林碱对顺铂抑制肺癌细胞增殖的增效作用。2、Annexin V/PI凋亡检测实验检测蝙蝠葛苏林碱对顺铂杀伤肺癌细胞的增效作用。3、Western blot实验检测蝙蝠葛苏林碱对顺铂杀伤肺癌细胞的增效作用。4、Western blot实验检测蝙蝠葛苏林碱对线粒体凋亡相关蛋白指标的影响。(5)蝙蝠葛苏林碱增效顺铂杀伤肺癌细胞的机制研究1、Mitotraker染色实验检测蝙蝠葛苏林碱联合顺铂对肺癌细胞线粒体形态的影响。2、COX4免疫荧光染色(流式检测)检测蝙蝠葛苏林碱联合顺铂对肺癌细胞中线粒体总量的影响。3、电镜及荧光实验检测蝙蝠葛苏林碱联合顺铂作用是否会导致线粒体自噬体的累积。4、Western blot实验检测蝙蝠葛苏林碱联合顺铂对线粒体分裂相关蛋白DRP1 637位点磷酸化的影响。5、流式细胞术结合荧光探针标记检测蝙蝠葛苏林碱联合顺铂对肺癌细胞中ROS水平的影响。6、流式细胞术结合H2DCFDA绿色荧光探针标记检测DRP1抑制剂对蝙蝠葛苏林碱联合顺铂造成的ROS累积的影响。7、Mitotraker染色实验检测清除ROS是否会逆转蝙蝠葛苏林碱联合顺铂引起的线粒体碎片化。8、Western blot实验结合线粒体提取实验检测清除ROS是否可以逆转蝙蝠葛苏林碱联合顺铂引起的线粒体自噬体的累积。9、CCK8实验检测清除ROS是否可以逆转蝙蝠葛苏林碱联合顺铂对肺癌细胞的抑制作用。10、Western blot实验检测清除ROS是否可以逆转蝙蝠葛苏林碱联合顺铂引起的肺癌细胞线粒体凋亡。11、Western blot实验检测蝙蝠葛苏林碱联合顺铂对MAPK通路的影响以及ROS清除后的变化。12、CCK8实验检测抑制p38能否逆转蝙蝠葛苏林碱联合顺铂对肺癌细胞的抑制作用。13、CCK8实验检测抑制JNK能否逆转逆转蝙蝠葛苏林碱联合顺铂对肺癌细胞的抑制作用。(6)蝙蝠葛苏林碱增效顺铂的肺癌移植瘤模型1、裸鼠移植瘤实验检测蝙蝠葛苏林碱联合顺铂对裸鼠体内移植瘤体积的影响。2、裸鼠移植瘤实验检测蝙蝠葛苏林碱联合顺铂对裸鼠体内移植瘤重量的影响。三.结果:(1)蝙蝠葛苏林碱可以抑制肺癌细胞晚期自噬流1、蝙蝠葛苏林碱处理可以使肺癌细胞中自噬小体数量明显增多。2、蝙蝠葛苏林碱可显著上调肺癌细胞中p62及LC3-Ⅱ水平。3、蝙蝠葛苏林碱可显著抑制肺癌细胞晚期自噬流。(2)蝙蝠葛苏林碱通过抑制溶酶体酸化抑制肺癌细胞晚期自噬流1、蝙蝠葛苏林碱不影响肺癌细胞自噬体和溶酶体的融合过程。2、LysoTraker实验确定蝙蝠葛苏林碱可以显著抑制肺癌细胞溶酶体酸度。3、吖啶橙染色实验确定蝙蝠葛苏林碱可以显著抑制肺癌细胞溶酶体酸度。4、蝙蝠葛苏林碱可以显著抑制肺癌细胞中溶酶体酸性水解酶的成熟。(3)蝙蝠葛苏林碱通过TPC2-ITPR2相关通路激活钙信号进而抑制溶酶体酸化1、转录组学测序结果显示蝙蝠葛苏林碱可调控钙信号相关通路。2、钙拮抗剂可逆转蝙蝠葛苏林碱引起的抑制自噬相关蛋白指标的变化。3、钙拮抗剂可逆转蝙蝠葛苏林碱引起的溶酶体酸化抑制。4、蝙蝠葛苏林碱可以引起肺癌细胞内钙离子升高。5、蝙蝠葛苏林碱通过激活ITPR2和TPC2引起钙离子升高。6、下调ITPR2或TPC2可逆转蝙蝠葛苏林碱引起的酸化抑制。(4)蝙蝠葛苏林碱可以增强顺铂对肺癌细胞的杀伤作用1、CCK8实验确定蝙蝠葛苏林碱对顺铂抑制肺癌细胞增殖有显著增效作用。2、Annexin V/PI凋亡检测实验证明蝙蝠葛苏林碱对顺铂杀伤肺癌细胞有显著增效作用。3、Western blot实验证明蝙蝠葛苏林碱对顺铂杀伤肺癌细胞有显著增效作用。4、蝙蝠葛苏林碱可以增强顺铂引起的肺癌细胞线粒体凋亡。(5)蝙蝠葛苏林碱通过ROS-JNK通路增效顺铂杀伤肺癌细胞1、蝙蝠葛苏林碱联合顺铂加剧了肺癌细胞线粒体的碎片化。2、蝙蝠葛苏林碱联合顺铂引起了肺癌细胞中线粒体总量的增多。3、电镜及荧光实验证明蝙蝠葛苏林碱联合顺铂导致了线粒体自噬体的大量累积。4、蝙蝠葛苏林碱联合顺铂引起的线粒体碎片化受DRP1蛋白637位点的磷酸化调控。5、蝙蝠葛苏林碱联合顺铂使肺癌细胞中ROS水平显著升高。6、抑制DRP1可以逆转蝙蝠葛苏林碱联合顺铂引起的肺癌细胞中ROS水平的升高。7、清除ROS可以逆转蝙蝠葛苏林碱联合顺铂引起的线粒体碎片化。8、清除ROS可以逆转蝙蝠葛苏林碱联合顺铂引起的线粒体自噬体的累积。9、清除ROS可以逆转蝙蝠葛苏林碱联合顺铂对肺癌细胞的抑制作用。10、清除ROS可以逆转蝙蝠葛苏林碱联合顺铂引起的肺癌细胞线粒体凋亡。11、蝙蝠葛苏林碱联合顺铂引起的JNK和p38通路的激活且可被ROS清除剂NAC逆转。12、抑制p38并不能逆转蝙蝠葛苏林碱联合顺铂对肺癌细胞的抑制作用。13、抑制JNK可以逆转蝙蝠葛苏林碱联合顺铂对肺癌细胞的抑制作用。(6)蝙蝠葛苏林碱在体内可协同增效顺铂对肺癌移植瘤的抑制1、蝙蝠葛苏林碱联合顺铂对裸鼠体内移植瘤体积相较于顺铂单独作用组具有更强的抑制作用。2、蝙蝠葛苏林碱联合顺铂对裸鼠体内移植瘤重量相较于顺铂单独作用组具有更强的抑制作用。四.结论:1、蝙蝠葛苏林碱通过TPC2-TTPR2信号通路激活肺癌细胞内钙信号,进而抑制溶酶体酸化,阻断肺癌细胞晚期自噬流,发挥抑制自噬作用。2、蝙蝠葛苏林碱联合顺铂通过抑制损伤线粒体的清除在肺癌细胞中累积过量ROS,进而通过ROS-JNK通路协同杀伤肺癌细胞。3、蝙蝠葛苏林碱在体内可以增效顺铂对人肺癌细胞裸鼠移植瘤的抑制作用,与体外实验结果相一致。