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研究背景：原发性肝细胞癌(HCC)恶性程度高、预后差,是危害我国居民健康的重大疾病,而其多药耐药(MDR)现象更是影响内科药物治疗疗效的重要因素。深入探讨HCC恶性增殖和药物抵抗的机制、寻找有效的干预靶点已经成为肝癌研究的热点。肝癌细胞始终处于病毒感染、营养缺乏、炎症刺激等各种不良的微环境中,这些不良刺激加上肿瘤的恶性增殖会使得大量未折叠／错误折叠蛋白在内质网腔内的积聚,导致内质网应激(ERS)状态。研究证实,ERS以及其引发的未折叠蛋白反应(UPR)与众多的细胞内信号转导途径相关,因此探讨ERS状态下的肝癌细胞增殖、生存和死亡的机制具有重要的意义。自噬是细胞在缺氧、营养缺乏环境下通过自身降解来维持生存和细胞稳态的重要机制。近年研究表明,自噬与肿瘤的发生发展及肿瘤的治疗均有密切关系,但自噬究竟是发挥促癌还是抑癌的作用目前尚无定论。研究ERS状态下肝癌细胞的自噬活性的变化,以及自噬在肝癌细胞生存和死亡中的作用有助于进一步阐明肝癌的恶性生物学的分子基础和药物抵抗机制。研究目的：①观察ERS诱导剂衣霉素(TM)对肝癌细胞自噬活性的影响；②研究细胞自噬在ERS诱导的肝癌细胞死亡中的作用；③探讨化疗药物对肝癌细胞自噬的影响及调控自噬对肝癌细胞药物敏感性的影响。方法：肝癌细胞株HepG2、HepG2.2.15和Bel-7402分别培养于含10%胎牛血清的DM EM、MEM和RPM11640培养基中；正常肝细胞L-02培养于含10%胎牛血清的DMEM中。采用CCK-8法检测细胞活力,并根据细胞活力值在OriginPro8.5.1软件中进行剂量效应曲线拟合,分别计算TM及奥沙利铂(Oxa)对各细胞株的半数抑制浓度(IC5o),据此设计自噬诱导试验的浓度。免疫印迹法检测ERS标志蛋白GRP78的表达及caspase-3蛋白的切割情况。自噬的检测与评价包括以下4个方而：a)形态学定性：采用透射电子显微镜法(TEM)观察自噬体的超微结构,以EBSS和雷帕霉素处理的细胞作为自噬诱导的阳性对照；b)细胞爬片经免疫荧光染色,在激光共聚焦显微镜下观察LC3蛋白在胞浆内的定位表达情况；c)免疫印迹法检测自噬性LC3-Ⅰ蛋白向LC3-Ⅱ蛋白的转变(conversion试验)并进行定量分析；d)自噬潮(autophagic flux)分析：以氯喹(CQ)作为溶酶体抑制剂,观察CQ存在与不存在的情况下LC3-Ⅱ蛋白表达的变化(LC3turnover试验),以全面评价自噬性降解功能。结果：①肝癌细胞和正常细胞对ERS刺激的耐受性：在相同浓度TM刺激下,3种肝癌细胞株(HepG2、HepG2.2.15和Bel-7402)的细胞活力均高于正常肝细胞L-02的活力。②ERS诱导剂对HepG2细胞活力的影响：HepG2细胞的活力随TM作用时间的延长和剂量的增加而下降；经计算后,TM对HepG2细胞的ICso值=6.4606μg/ml;且TM处理的HepG2细胞中见caspase-3蛋白的切割现象。③HepG2细胞内ERS标志蛋白GRP78表达的变化：免疫印迹检测证实,TM刺激可以引起HepG2细胞GRP78蛋白表达的上调.GRP78蛋白表达水平与TM的浓度呈正相关,且随着TM作用时间的延长,GRP78表达水平逐渐增加。④ERS对肝癌HepG2细胞自噬的影响：a)TEM观察发现,2.5μg/ml TM作用24小时后的HepG2细胞中自噬体(即包裹着胞浆成分的囊泡样结构)较对照组明显增多。b)激光共聚焦显微镜下亦发现LC3蛋白在TM处理后的HepG2细胞中的表达明显增加,呈点状聚集现象。c) Western-Blot证实ERS后的HepG2细胞出现了自噬性的LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ转变。2.5μg/ml和5μg/ml的TM作用于HepG2后,与对照组相比,LC3-Ⅰ蛋白表达下调,同时LC3-Ⅱ蛋白表达上调；条带定量分析的结果提示TM处理组的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ光密度比值大于对照组,且LC3-Ⅱ/FLC3-Ⅰ光密度比值随TM处理时间的增加而增加；而自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)可抑制LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转变。d)自噬潮分析(LC3turnover试验)的结果示：CQ抑制溶酶体后,LC3-Ⅱ蛋白表达水平较不加CQ的相同浓度的TM组明显增多;定量分析结果提示TM+CQ组的LC3-Ⅱ光密度值较不加CQ的相同浓度TM组增加；同时,TEM亦证实CQ存在时,TM处理的HepG2细胞中出现更多的自噬体的积聚。以上结果说明了ERS诱导的HepG2细胞自噬增加是自噬功能增强的结果,而非自噬性降解缺陷所致自噬体积聚。⑤抑制自噬对ERS状态下HepG2细胞活力的影响：在加入TM前1小时加入3-MA用来抑制自噬的发生,结果发现抑制自噬可增加ERS状态下的HepG2细胞死亡；提高3-MA浓度,细胞活力下降更明显。而提前加入CQ则对ERS状态下的肝癌细胞活力影响不大。⑥奥沙利铂(Oxa)对HepG2细胞自噬的影响：电镜下,Oxa作用下的HepG2细胞自噬体增加；Western-Blot证实Oxa诱导LC3-Ⅱ蛋白的表达增加,而且CQ抑制溶酶体后LC3-Ⅱ蛋白的表达进一步增加。以上结果说明Oxa可以诱导HepG2细胞的自噬增加。⑦自噬抑制对肝癌细胞药物敏感性的影响：3-MA可以下调LC3-Ⅱ的表达,抑制自噬的发生。3-MA+Oxa共处理可以引起肝癌HepG2和HepG2.2.15细胞活力的显著下降。CQ+Oxa联合处理24小时对肝癌细胞活力影响不大,48小时后的活力则较Oxa单独处理组明显下降。结论：与正常肝细胞相比,肝癌细胞对ERS刺激的耐受性更强；ERS可以诱导肝癌HepG2细胞自噬的形成增加和自噬潮的增强,且随着ERS诱导剂TM作用时间和剂量的增加而增加；自噬活性增强是肝癌HepG2细胞耐受ERS刺激的重要机制,自噬抑制剂3-MA可以增加ERS诱导的HepG2细胞死亡；奥沙利铂引起肝癌细胞自噬增加,而抑制自噬能够增加肝癌HepG2和HepG2.2.15细胞对奥沙利铂的敏感性,自噬抑制可能是化疗增敏的潜在靶点。研究为进一步阐明肝癌细胞恶性生物学行为的细胞学基础,以及寻找有效的干预靶点和化疗增敏剂的研发提供理论依据。