研究背景氯胺酮被广泛用于婴幼儿手术，为N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate，NMDA）受体离子通道非选择性拮抗剂，文献报道其能够导致发育期神经元广泛的剂量依赖性的凋亡。一些文献显示，暴露于NMDA受体拮抗剂MK801等，实验动物呈现远期海马突触功能以及持续性的学习记忆功能受损。这显示突触NMDA受体介导的膜去极化通过激活激酶信号介导的促存活基因蛋白表达产物在触发以及维持神经营养支持中起着非常重要的作用。NMDA受体是一种离子通道型谷氨酸能受体，能够特异性地被其选择性的激动剂NMDA激活。NMDA受体的激活会导致允许Na⁺、K⁺以及Ca²⁺离子流动的通道的开放。通过NMDA受体的钙内流会导致下游多种信号分子的激活，构成许多生理过程，例如突触可塑性、学习和记忆的基础。体外研究证实，突触NMDA受体的神经营养作用主要是通过细胞外信号调节蛋白激酶（extracellular signal-regulated protein kinase，ERK1／2），钙／钙调蛋白依赖性激酶IV(Ca²⁺／CaMK)以及cAMP反应原件结合蛋白（cAMP response-binding protein，CREB）发挥作用的。CREB是介导cAMP以及钙依赖性基因转录的中心转录因子。其Ser-133位点的磷酸化对启动转录非常重要，突变这一位点至丙氨酸会导致其转录活性的缺失。CREB调节大量促进神经元存活的基因的表达，其中神经营养因子基因BDNF以及抑凋亡基因Bcl-2为其研究最多的下游基因。神经营养因子在中枢神经系统的生长、发育以及突触可塑性中具有多种作用。钙内流诱导BDNF的转录能力由钙进入细胞内的路径不同而不同，通过诱导CREB磷酸化的方式不同进行调节。各种刺激主要通过升高细胞内cAMP以及Ca²⁺来激活CREB（见图1）。Ca²⁺／CREB／CREB结合蛋白（CREB banding protein，CBP）依赖性基因调节同时为长时程突触可塑性以及神经存活的重要机制。激活CREB信号通路涉及到调节神经元功能的两个主要的基因表达级联通路。第一，CREB作为分子开关的重要组成部分，通过调节形成包括突触素I在内的新突触所必需的基因的表达来控制神经可塑性。第二，与神经存活及保护有关的基因表达级联通路通过控制神经营养因子以及抗凋亡基因的转录。CREB依赖性的基因表达为中枢神经系统发育期神经细胞数量的维持以及随后突触发生以及神经分布所必需。因此本研究拟通过在体动物实验以及离体细胞培养从影响神经元存活以及突触形成、突触可塑性及远期学习记忆功能两方面来探讨氯胺酮致发育期海马神经元的神经毒性。本研究检验了以下假说（1）氯胺酮可诱导体内外发育期海马神经元的凋亡（2）氯胺酮会破坏体内外发育期海马神经元的突触形成（3）氯胺酮会导致远期学习记忆功能的损害（4）氯胺酮可通过阻断NMDA受体偶联钙离子通道使钙离子内流减少（5）氯胺酮下调CREB Ser-133位点的磷酸化（6）氯胺酮会下调其下游基因BDNF以及Bcl-2的表达减少突触素I的表达。研究方法与结果1．常用静脉麻醉药对发育期海马神经元细胞内钙浓度的影响方法：将原代培养第5d的大鼠海马神经元用10μmol／L的Ca²⁺指示剂Fluo-4共孵育30min，洗涤后，分别加入150μmol／L氯胺酮，3μmol／L咪达唑仑及10μmol／L丙泊酚在激光共聚焦显微镜下选定多个细胞分别测定荧光强度的变化。结果：氯胺酮使体外培养第5d的海马神经元代表钙浓度的荧光强度明显下降，由给药前987±307下降至给药后（766±226）（P＜0．05），咪达唑仑以及丙泊酚均使体外培养5d的海马神经元荧光强度明显升高：咪达唑仑由作用前（1707±514）升高至（2663±572）（P＜0．05），而丙泊酚由（1057±353）升高至（1749±708）（P＜0．05）。2．氯胺酮对发育期海马神经元神经存活的影响方法：1日龄新生SD大鼠进行原代海马神经元培养，体外培养至第5d，随机分对照组（C组）和氯胺酮组（K组），每组6孔。K组在含1000μmol／L氯胺酮的Neurobasel培养基中孵育3 h，采用Annexin V-PI凋亡试剂盒在流式细胞仪上检测两组神经元凋亡率的改变。结果：与对照组相比，氯胺酮组神经元早晚期凋亡率均增高（P＜0．05）3．氯胺酮对体外培养大鼠发育期海马神经元突触发生的影响方法：分组同前，氯胺酮共培养3h后两组神经元全量换液，体外培养至第14d，采用免疫荧光双标检测两组神经元突触素I的表达。使用FITC标记激发光下呈绿色荧光代表突触素I染胞浆，以及激发光下呈蓝色荧光的DAPI染核，观察体外培养第14d，神经元存活以及突触形成。结果：与对照组相比，氯胺酮组神经元细胞密度低，形成的突触连接少，突触素I的表达减少。4．氯胺酮对体外培养大鼠发育期海马神经元CREB信号的影响方法：体外培养第5d的海马神经元随机分为对照组（C组）以及氯胺酮组（K组）具体处理同上，采用免疫细胞化学检测两组神经元p-CREB的表达。免疫组化法测定神经元Ser-133位点磷酸化的CREB（p-CREB）表达，RT-PCR法半定量测定CREB下游基因脑源性生长因子（BDNF）和抑凋亡基因Bcl-2的表达。结果：与C组相比，p-CREB、BDNF、Bcl-2表达均下调（P＜0．05）。5．NMDA预处理能拮抗氯胺酮对体外培养大鼠发育期海马神经元磷酸化的影响方法：体外培养第5d的原代海马神经元随机分为6组即C组为对照组，K组为氯胺酮组即与1000μmol／L氯胺酮共培养3h，N₁组为2μoml／L NMDA共培养4h，N₂组为与10μoml／L NMDA共培养4h，N₁+K组2μoml／L NMDA共培养1h后与1000μmol／L共培养3h，N₂+K组10μoml／L NMDA共培养1h后再与1000μmol／L共培养3h，采用Western-blot检测各组神经元CREB以及p-CREB的表达，使用平均光密度值代表各组蛋白的表达量。结果：与对照组相比，各组神经元CREB的表达差异均无显著性（P＞0．05），N₂组p-CREB的表达增加，N₁+K组、N₂+K组以及K组p-CREB的表达均减少，与K组相比N₂+K组p-CREB的表达增加。6．氯胺酮对发育期大鼠海马神经元凋亡率的影响方法：7日龄SD大鼠随机分对照组（C组）、临床浓度氯胺酮组（K₁组）及超临床浓度氯胺酮组（K₂组）每组5只。K₁组和K₂组分别为皮下注射10mg／kg氯胺酮及皮下注射20mg／kg氯胺酮，给药重复7次，每次间隔90min。给药后1d，断头处死乳鼠，制成大脑冰冻切片，采用Tunel试剂盒检测各组大鼠海马神经元的凋亡率。结果：与C组相比，K₁、K₂组大鼠海马神经元凋亡率均有明显升高，分别由（0．82±1．66）％升高至（1．55±2．25）％（P＜0．05）和（2．77±2．42）％（P＜0．05）。7．氯胺酮致发育期大鼠海马突触形成的影响方法：7日龄SD大鼠随机分为对照组（C组）和临床浓度氯胺酮组（K₁组），超临床浓度氯胺酮组（K₂组），给药方式同前，每组5只。用药后均仔细观察乳鼠的皮肤颜色，有无缺氧表现。在麻醉期间均低浓度给氧（氧流量：2L／min）。麻醉清醒后，返回母鼠身边继续喂养。给药后7d，断头处死大鼠，分别采用免疫组织化学以及Western-blot检测突触前膜标记物突触素I以及突触后膜标记物PSD95的表达。分别采用IOD值以及相对灰度比值代表突触素素I以及PSD95的表达量。结果：与C组相比，K₂组突触素I以及PSD95的表达减少（P＜0．05），K₁组突触素I以及PSD95的表达差异无统计学意义（P＞0．05）。8．氯胺酮致发育期大鼠海马CREB信号通路的影响方法：7日龄SD大鼠随机分为对照组（C组）和临床浓度氯胺酮组（K₁组），超临床浓度氯胺酮组（K₂组），给药方式同前，每组10只。给药方式同前，麻醉清醒后，返回母鼠身边继续喂养，至给药后1d，断头处死大鼠，采用免疫荧光双标检测各组乳鼠p-CREB的表达，采用RT-PCR检测各组乳鼠BDNF、Bcl-2的表达。结果：与C组相比，K₁、K₂组大鼠代表p-CREB表达的IOD值分别由（2627．86±345．29）下降至（1607．98±97．63）（P＜0．05）和（967．58±61．24）（P＜0．05）、K₁、K₂组大鼠代表BDNF表达的相对灰度值分别由（1．355±0．147）下调至（1．241±0．004）（P＜0．05）和（0．863±0．009）（P＜0．05），K₁、K₂组大鼠代表Bcl-2表达的相对灰度值分别由（0．790±0．008）下调至（0．740±0．034）（P＜0．05）和（0．560±0．014）（P＜0．05）。9．氯胺酮对发育期大鼠成年后学习记忆功能的影响方法：7日龄SD大鼠随机分为对照组（C组）和临床浓度氯胺酮组（K₁组），超临床浓度氯胺酮组（K₂组），给药方式同前，每组10只。给药方式同前，麻醉清醒后，返回母鼠身边继续喂养，至给药后6周，采用Morris水迷宫检测各组大鼠学习记忆功能的改变，连续训练7d，7d后采用定位航行逃逸潜伏期以及空间探索实验中的潜伏时间、穿越原平台的次数以及目标想象所占探索时间比值和探索距离比值来评价各组大鼠空间学习记忆功能。结果：与对照组相比超临床浓度组大鼠Morris水迷宫潜伏时间由（5．12±3．24）延长至（10．83±6．48）（P＜0．05）。空间探索实验各组大鼠差异无统计学意义。统计学分析计量资料以均数±标准差（（?）±s）表示，采用SPSS 13．0软件进行数据处理，钙荧光强度采用配对t检验，离体试验中凋亡率、p-CREB、BDNF、Bcl-2采用成组t检验，其余结果比较采用单因素方差分析，P＜0．05为差异有统计学意义。研究总结一、主要研究结果1．通过离体原代神经元培养以及在体动物实验从神经元存活以及神经突触发生两个方面证实了氯胺酮致发育期海马神经元神经毒性。2．通过离体原代神经元培养证实氯胺酮对发育期海马神经元CREB上游NMDA受体的阻滞及对钙离子内流的影响。同时在在体动物以及离体细胞实验中均证实了氯胺酮对CREB信号通路即对p-CREB、BDNF、Bcl-2表达的影响。3．通过对临床浓度以及超临床浓度氯胺酮对发育期大鼠远期空间学习记忆功能的影响的研究。证实只有超临床浓度的氯胺酮才能够导致学习记忆功能部分受损。二、研究结论氯胺酮致发育期海马神经元神经毒性的作用可能主要通过非选择性的阻断NMDA受体钙离子通道，下调CREB Ser-133位点磷酸化，从而使得其下游对神经存活以及突触发生起重要作用的Bcl-2、BDNF以及突触素I表达减少来实现。