【摘 要】
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原核诱导表达dsRNA在有害生物防治领域具有潜在应用价值。通过原核诱导发酵产生dsRNA成本低廉,但表达dsRNA浓度、产量无法衡量,使得该方法在鞘翅目昆虫基因功能研究中还存在不足;dsRNA易受核酸酶降解,使得其稳定性以及降解检测技术研究有待丰富。因此,本研究以720bp绿色荧光蛋白(GFP)为模板,构建不同长度、不同GC含量的p ET-2p-dsgfp、L4440-dsgfp表达载体;其次以体
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原核诱导表达dsRNA在有害生物防治领域具有潜在应用价值。通过原核诱导发酵产生dsRNA成本低廉,但表达dsRNA浓度、产量无法衡量,使得该方法在鞘翅目昆虫基因功能研究中还存在不足;dsRNA易受核酸酶降解,使得其稳定性以及降解检测技术研究有待丰富。因此,本研究以720bp绿色荧光蛋白（GFP）为模板,构建不同长度、不同GC含量的p ET-2p-dsgfp、L4440-dsgfp表达载体;其次以体外合成dsgfp为对照,比较分析4种方法提取dsgfp纯度,运用内标混合纯dsgfp法计算提取方法损失率、分析p ET-2p-dsgfp以及L4440-dsgfp表达量以初步确定dsgfp的最佳提取方法和相对最优表达载体;最后对室温环境下EP管静置、马铃薯叶片涂抹dsgfp降解产物进行电泳灰度分析以及Chip-seq测序技术以获得相对稳定的dsgfp。主要研究内容与结果如下:1、人工合成了5组目的片段分别为:201bp长度的30%GC含量的GFP（简称201-30GC,下同）、201-50GC、423-30GC、423-50GC、423-70GC。将其分别克隆至p ET-2p、L4440载体,获得p ET-2p-dsgfp以及L4440-dsgfp表达载体,灰度分析发现p ET-2p-dsgfp表达量高于L4440-dsgfp。2、以体外合成dagfp为空白对照进行多重方差分析,其中提取纯度最高的是Trizol法和酚氯仿法,A260/A280、A260/A230均值分别可达1.83、1.79;1.78、2.1;运用内标混合纯dsRNA方法检测Trizol法、酚氯仿法、RNA-easy提取液和75%酒精沉淀法的损失率分别为23.88%、21.44%、32.3%和37.62%;用酚氯仿法分别提取1ml诱导菌液发现两种载体表达同一dsgfp浓度具有显著差异（P<0.05）,p ET-2p-dsgfp和L4440-dsgfp可分别诱导发酵产生8.7～24.39μg/ml、7.48～22.47μg/ml dsgfp。进一步说明p ET-2p-dsgfp表达能力高于L4440-dsgfp。3、室温环境下单因素方差统计得出423-70GC较稳定。运用Chip-seq技术测序发现423-70GC成功比对序列百分比为1794109（3.37%）、平均比对质量分数为40.23均优于其他dsgfp,进一步表明423-70GC稳定性最好。
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