目的：环氧酶-2(COX-2)在肝细胞癌发病中的作用近年来逐渐被认识,COX-2可能通过促进细胞增殖抑制凋亡,增强癌细胞侵袭转移能力,促进肿瘤血管生成等多方面的作用参与肝细胞癌的发生和发展。目前多认为COX-2的作用是通过前列腺素E2 (PGE2)产生的,后者与胞膜EP受体结合后发挥促肿瘤生长和转移的作用,但具体的细胞内信号转导通路尚不清楚。Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)信号通路在调控细胞的生长、运动和分化,以及在胚胎发育和肿瘤发生及侵袭转移过程中起重要作用,已被确认是与肿瘤相关的一个关键性信号通路。近年来的研究发现在30%-40%的肝细胞癌细胞中存在β-catenin的高表达和核内聚集,Wnt/β-catenin信号通路在肝癌细胞中被激活。本课题拟研究COX-2和PGE2对人肝细胞癌Hep3B细胞增殖以及细胞内Wnt/β-catenin信号通路的调控作用,试图阐明COX-2促肝癌生长的分子机制。方法：一、采用逆转录—聚合酶链反应(RT-PCR)检测人肝细胞癌Hep3B细胞和人正常肝细胞系QSG7701细胞内COX-2mRNA和PGE2 EP受体mRNA的表达,CCK-8细胞计数法检测PGE2、特异性的EP2受体激动剂布他前列素(butaprost)、EP3/EP4受体激动剂乙醇前列腺素E1 (PGE1 alcohol)以及选择性的COX-2抑制剂尼美舒利对细胞增殖活性的影响,并观察PGE2对尼美舒利作用的影响,确定药物作用的量效和时效关系。二、用阳离子脂质体对Hep3B细胞进行COX-2 siRNA (small interfering RNA)的转染,RT-PCR检测COX-2 mRNA表达水平的变化,CCK-8细胞计数法检测COX-2基因表达下调后对细胞增殖活性的影响。三、设计靶向COX-2基因的RNA干扰序列,构建作用于COX-2 mRNA的发卡状RNA(COX-2 shRNA)的表达载体,进行Hep3B细胞转染,并筛选稳定表达COX-2 shRNA的细胞。采用RT-PCR检测COX-2 mRNA表达水平的变化,CCK-8法考察COX-2 shRNA表达质粒转染Hep3B细胞后对细胞增殖的影响。四、将用以检测β-catenin/TCF/LEF转录活性的荧光素酶报告质粒TOPflash和FOPflash转染肝癌Hep3B细胞,使用双荧光素酶报告系统分别测定PGE2、butaprost、尼美舒利和COX-2shRNA对细胞内荧光素酶转录活性的影响,以确定PGE2和COX-2是否影响β-catenin/TCF/LEF的转录活性。对Hep3B细胞进行β-catenin siRNA的转染,检测β-catenin基因表达下调后对PGE2促细胞增殖作用的影响,阐明Wnt/β-catenin信号通路是否与PGE2的促生长效应相关。五、采用免疫印迹技术分别检测PGE2和COX-2shRNA对肝癌Hep3B细胞内β-catenin和磷酸化β-catenin (Ser33/37/Thr41)的影响,探讨PGE2和COX-2对β-catenin的作用。采用免疫印迹技术检测PGE2刺激Hep3B细胞后,细胞内糖原合成激酶-3β(GSK-3β)、磷酸化的GSK-3β(Ser9)、蛋白激酶B (Akt)和磷酸化Akt (Thr308)蛋白水平的变化,并观察磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol-3-kinase, PI3K)抑制剂沃曼青霉素(wortmannin, WM)预处理Hep3B细胞后再给予PGE2刺激,细胞内Akt、GSK-3β磷酸化水平和β-catenin/TCF/LEF转录活性的变化,探讨PGE2是否通过PI3K-Akt途径对GSK-3β磷酸化后激活Wnt/β-catenin信号通路。结果和讨论：人肝细胞癌Hep3B细胞高表达COX-2 mRNA,而正常肝细胞QSG7701 COX-2 mRNA表达水平远远弱于前者。四种亚型的PGE2受体EP1-EP4的mRNA在Hep3B细胞中均有表达,其中EP1和EP3受体表达水平较低,而EP2和EP4受体表达水平较高。0.1、1和10μmol/L的PGE2作用Hep3B细胞72h后,细胞增殖活性分别较对照组上升12.13%(P<0.01)、17.58%(P<0.01)和33.07%(P<0.001)。但当浓度达到100μmol/L时,PGE2表现出显著的细胞毒性作用。EP2受体激动剂butaprost孵育细胞72h使细胞增殖活性提高了21.96%(P<0.001),而EP3/EP4受体激动剂PGE1 alcohol在浓度为2-20μmol/L的范围内对Hep3B细胞增殖活性无显著影响,当浓度达到200μmol/L时则对细胞的增殖产生一定的抑制作用P<0.001)。结果提示EP2受体主要介导了PGE2对Hep3B细胞的促增殖作用。选择性的COX-2抑制剂尼美舒利在浓度为25、50、100和200μmol/L时对Hep3B细胞增殖的抑制率分别为19.78%(P<0.001)、43.28%(P<0.001)、54.98%(P<0.001)和72.85%(P<0.001),其半数抑制浓度为77.33μmol/L。当10μmol/LPGE2与100μmol/L尼美舒利共同孵育细胞72h后,与单独加入尼美舒利相比,细胞活力显著增强(P<0.001)。PGE2对尼美舒利抗Hep3B细胞增殖作用的拮抗提示,尼美舒利通过抑制COX-2的活性和PGE2的生成发挥抗肝癌细胞增殖的作用。RT-PCR检测显示,COX-2 siRNA可显著下调Hep3B细胞内COX-2 mRNA的表达水平。转染40nmol/L的COX-2 siRNA 24-72h后细胞增殖活性分别下降为转染阴性对照siRNA组的87.34%±4.07%,75.30%±7.55%(P<0.05)和63.58%±3.41%(P<0.05)。PCR和质粒测序结果证明已成功构建COX-2 shRNA表达载体。转染COX-2 shRNA表达载体并用G418进行筛选,得到稳定表达COX-2 shRNA的Hep3B细胞。实验发现,稳定表达COX-2 shRNA的细胞增殖活性较未转染的细胞下降了45.98%(P<0.001),表达错义序列的细胞与未转染的细胞增殖活性无显著差异。上述结果表明,COX-2基因下调可在一定程度上抑制表达COX-2的Hep3B细胞的增殖。免疫印迹分析检测发现,10μmol/L的PGE2作用Hep3B细胞30min后,细胞内β-catenin蛋白含量增加,作用1h后β-catenin蛋白水平升高更加明显,作用8h后β-catenin蛋白含量仍保持显著增加。与之相反,PGE2作用Hep3B细胞30min后,磷酸化的β-catenin(Ser33/37/Thr41)水平明显下降。结果表明,PGE2可显著抑制Hep3B细胞内β-catenin蛋白的磷酸化,同时增加细胞内β-catenin蛋白的含量。为进一步探讨Hep3B细胞内COX-2与β-catenin信号通路的关系,我们检测了稳定表达COX-2shRNA的Hep3B细胞中β-catenin和磷酸化的β-catenin的蛋白表达水平。结果显示,COX-2shRNA在下调Hep3B细胞内COX-2基因表达的同时,显著抑制β-catenin的表达,并增强了磷酸化的β-catenin的蛋白表达水平。由于β-catenin的磷酸化是其在细胞内降解的关键步骤,上述结果提示,COX-2基因表达下调可促进β-catenin的磷酸化和降解,从而起到抑制Hep3B细胞增殖的作用。双荧光素酶报告系统检测发现,0.1、1、10μmol/L的PGE2分别使Hep3B细胞内β-catenin/TCF/LEF转录活性上升为对照组的122.05%±13.34%,167.79%±27.70%(P<0.05)和201.08%±25.47%(P<0.01)。20μmol/L的EP2受体激动剂butaprost的处理Hep3B细胞16h后,β-catenin/TCF/LEF的转录活性提高了93.05%(P<0.05)。结果提示,PGE2具有激活Wnt/β-catenin信号通路的作用,此作用可能通过EP2受体介导。实验同时发现,稳定表达COX-2 shRNA的Hep3B细胞内β-catenin/TCF/LEF的转录活性较未转染的细胞下降了37.07%(P<0.05),提示COX-2基因表达下调可抑制人肝细胞癌Hep3B细胞内β-catenin依赖的基因转录。实验进一步研究COX-2选择性抑制剂尼美舒利对β-catenin/TCF/LEF的转录活性的影响,发现尼美舒利(100 pmol/L)显著抑制β-catenin/TCF/LEF的转录活性(P<0.05),而PGE2则显著对抗尼美舒利的作用(P<0.05)。100μmol/L尼美舒利使β-catenin/TCF/LEF的转录活性下降为阴性对照组的54.47%。当10μmol/LPGE2与100μmol/L尼美舒利共同孵育细胞,β-catenin/TCF/LEF的转录活性为阴性对照组的86.49%,与单100独加入pmol/L尼美舒利相比,转录活性明显增强。此结果表明尼美舒利可能通过抑制COX-2的活性和PGE2的产生,从而影响P-catenin的活性,最终产生抗肝癌细胞增殖的作用。为阐明Wnt/β-catenin信号通路的激活是否在PGE2促Hep3B细胞增殖的过程中发挥作用,实验进一步研究了P-catenin siRNA对PGE2促Hep3B细胞增殖作用的影响。研究发现,在转染阴性对照siRNA的细胞处理组中,10 pmol/L的PGE2作用细胞72h后使细胞增殖活性增加29.52%(P<0.05),而在转染β-catenin siRNA的细胞处理组中,10μmol/L的PGE2处理组但与未加PGE2的对照组相比无显著性差异(P>0.05)。实验结果显示,β-catenin基因表达下调能显著抑制PGE2促Hep3B细胞增殖的作用,表明Wnt/β-catenin信号通路的激活在PGE2促Hep3B细胞增殖的过程中起关键作用。GSK-3β是Wnt/β-catenin信号通路中的关键组分,它通过磷酸化β-catenin促使其被蛋白酶降解,而GSK-3β活性的下降则可导致β-catenin蛋白水平和活性增加。GSK-3β被上游激酶磷酸化是其活性下降的重要途径。实验发现,10μmol/L的PGE2作用Hep3B细胞15-60min内,细胞内磷酸化的GSK-3p(Ser9)蛋白含量显著增加,以15-30min内增加最为明显。实验同时显示,10 pmol/L的PGE2对Hep3B细胞内GSK-3β蛋白水平无影响。该结果提示,PGE2通过磷酸化Hep3B细胞内GSK-3p,使其活性下降,从而起到增强β-catenin活性的作用。Akt是GSK-3β上游主要的激酶,此激酶磷酸化后被激活,通过磷酸化下游GSK-3β下调后者的活性。研究发现,10μmol/L的PGE2对Hep3B细胞内Akt蛋白水平无影响。10μmol/L的PGE2作用Hep3B细胞15-120min内,细胞内磷酸化的Akt(Thr308)蛋白含量显著增加,以15-30min内增加最为明显。实验结果提示,PGE2通过磷酸化Hep3B细胞内Akt激酶,从而启动下游GSK-3p的磷酸化。Akt是PI3K下游的靶蛋白,PI3-K特异性剂抑制WM预处理Hep3B细胞15min后,可显著抑制10μmol/L的PGE2促进GSK-3B和Akt蛋白磷酸化的作用。WM预处理Hep3B细胞同时可显著抑制PGE2增强β-catenin/TCF/LEF转录活性的作用。在没有使用WM预处理的对照组中,10μmol/L的PGE2作用细胞72h后使细胞内β-catenin/TCF/LEF转录活性增加111.49%(P<0.001),而使用WM预处理细胞15min后,PGE2仅使细胞β-catenin/TCF/LEF转录活性增加41.71%(P<0.05)。实验结果表明,PGE2通过活化PI3K-Akt通路,磷酸化下游GSK-3p激酶,进而抑制β-catenin降解,从而激活β-catenin/TCF/LEF依赖的基因转录。结论：PGE2和EP2受体激动剂促进表达COX-2和EP受体的肝细胞癌Hep3B细胞的增殖,而COX-2抑制剂和COX-2基因下调均能抑制Hep3B细胞的增殖,表明COX-2和其催化生成的PGE2具有促进肝细胞癌生长的作用,此作用可能通过细胞膜上的EP2受体介导。PGE2抑制Hep3B细胞内β-catenin蛋白的磷酸化,增加Hep3B细胞内β-catenin蛋白含量,增强β-catenin/TCF/LEF的转录活性；EP2受体激动剂butaprost显著增强β-catenin/TCF/LEF的转录活性,作用与PGE2类似；COX-2基因表达下调促进Hep3B细胞内β-catenin蛋白的磷酸化,降低Hep3B细胞内β-catenin蛋白水平,抑制β-catenin/TCF/LEF的转录活性；COX-2抑制剂尼美舒利显著抑制β-catenin/TCF/LEF的转录活性,此作用可被PGE2削弱；β-catenin基因下调显著抑制PGE2的促增殖作用。上述结果表明COX-2和其催化生成的PGE2通过抑制细胞内β-catenin蛋白的磷酸化和降解,增强β-catenin/TCF/LEF的转录活性,产生促进Hep3B细胞增殖的作用。PGE2促进Hep3B细胞Akt和GSK-3β的磷酸化,此作用可被PI3K特异性的抑制剂WM所阻断。WM同时可对抗PGE2增强β-catenin/TCF/LEF转录活性的作用,此结果提示,PGE2通过活化PI3K-Akt通路,磷酸化下游GSK-3p激酶,进而抑制β-catenin降解,从而激活β-catenin/TCF/LEF依赖的基因转录。综上所述,COX-2和PGE2通过EP2受体和PI3K-Akt途径激活Wnt/β-catenin通路,从而发挥促进肝细胞癌Hep3B细胞生长的作用。