据报道2018年全球新增癌症患者1810万例,死亡病例960万,1/5男性、1/6女性会患上癌症,1/8男性、1/11女性会因癌症而死亡。由于大多数肿瘤缺乏可用于检测的特异性生物标志物和明显的临床症状,所以60%以上的患者在被确诊时可能已处于中、晚期。研究表明虽然全国恶性肿瘤的年龄别死亡率在45岁之前还处在一个较低水平,但在45岁以后开始快速升高,85岁以上达到了一个最高点。随着我国人口老龄化的加重和癌症形势的严峻性,发现肿瘤特异的生物学标志物变得尤为重要。外泌体是一种由细胞通过内吞-融合-外排等一系列生物学过程产生并主动分泌出细胞外的脂质双分子层膜性囊泡。由于肿瘤微环境长期保持低氧状态,导致肿瘤细胞分泌丰富的携带着病理性或生理性标志蛋白质、mRNA、miRNA、LncRNA、环状RNA等信号分子的外泌体,影响着细胞的生理过程例如肿瘤细胞的生长、迁移、细胞与细胞间的通讯等,所以检测外泌体所携带的特异表达标志蛋白可用于肿瘤的早期临床诊断、临床风险或治疗效果的评估,以及预后的判定等。目前分离外泌体的方法主要有超速离心法和试剂盒法,超速离心法虽然可以提取到较高纯度的外泌体,但操作步骤比较繁杂且超速离心机价格昂贵;试剂盒提取法虽然较为简便,但提取纯度不够。如能通过外泌体膜蛋白建立新的外泌体分离技术,则可极大地促进外泌体的研究。随着人类基因组计划的实施,蛋白质组学的功能研究已经成为了后基因组时代的一个核心内容。而质谱分析作为蛋白质鉴定最有力的工具之一,具有高灵敏度,肽段分离和鉴定同步进行等优点,更能增加疾病诊断、预后判断的可靠性,如今被广泛应用于医学领域研究中。随着外泌体研究的不断深入,外泌体蛋白组学的成果也不断涌现。有研究表明可以通过流式细胞术联合肿瘤细胞特异分泌的膜蛋白来分离肿瘤细胞外泌体,并根据膜蛋白在肿瘤发生中的功能来诊断或筛查肿瘤。但目前对于外泌体膜蛋白的研究还鲜有报道。因此,通过对细胞外泌体的验证,以及对肝癌细胞外泌体与肝细胞外泌体相对定量蛋白组学结果的分析,来发现肝癌细胞外泌体特异高表达膜蛋白,希望能为肿瘤外泌体分离纯化提供新的角度和思路。第一部分,主要对细胞外泌体进行分离纯化和验证,分析细胞外泌体相对定量蛋白图谱数据,筛选出肝癌细胞外泌体特异高表达膜蛋白;第二部分,对本研究第一部分筛选出的候选膜蛋白进行qRT-PCR、Western blot、免疫荧光等验证和生物信息学分析。第一部分外泌体的鉴定及相对定量蛋白图谱的分析目的利用改良式超速离心法提取细胞外泌体,验证获得的外泌体并对细胞外泌体进行相对定量蛋白图谱测定,筛选出肝癌细胞外泌体中特异高表达蛋白。方法1.饥饿培养法培养人正常肝细胞HL-7702、人肝癌细胞HepG2、SMCC-7721,收集细胞培养上清液,利用课题组前期研究的改良超速离心法分离纯化细胞外泌体。2.透射电子显微镜观察细胞外泌体形态结构,Western Blot验证外泌体特异蛋白HSP70、CD9、Alix的表达,Nanosight检测外泌体粒径大小及浓度。3.通过LC-MS/MS相对定量蛋白组学检测分析正常肝细胞HL-7702、肝癌细胞HepG2、SMMC-7721细胞外泌体蛋白图谱。4.筛选出SMMC-7721、HepG2两种肝癌细胞外泌体共同表达的蛋白,运用Uniprot标准化蛋白名称、DAVID基因功能注释、KEGG富集通路等分析共同表达蛋白,将共同表达蛋白与HL-7702正常肝细胞外泌体蛋白进行比较,得到肝癌细胞外泌体特异高表达的候选蛋白。5.对筛选出来的候选蛋白进行GO分类分析,了解各个候选蛋白的亚细胞定位和分布情况。结果1.透射电子显微镜镜下可观察到HepG2肝癌细胞外泌体形态呈椭圆形,具有典型的脂质双分子层膜结构;Western blot结果表明,利用改良超速离心法提取到的HL-7702、HepG2细胞培养上清液颗粒沉淀物,均能检测到外泌体特异蛋白CD9、Alix、HSP70的表达;Nanosight检测颗粒浓度(particles/mL)为1.12×10~9,峰值在58.2nm,中间值在74.8 nm。以上三个实验均表明改良超速离心法有效分离出高纯度的细胞外泌体。2.经Uniprot数据库检索发现相对定量蛋白组学检测出HepG2肝癌细胞外泌体共表达蛋白2879个,SMMC-7721肝癌细胞外泌体共表达蛋白2426个,筛选出HepG2、SMMC-7721两种肝癌细胞外泌体共同表达的蛋白845个,除去9个具有相同名称的蛋白,共同表达蛋白剩836个。3.对这836个蛋白进行KEGG通路富集分析,共富集到与肝癌相关通路34条,参与这34条通路但在HL-7702正常肝细胞外泌体中不表达的蛋白有75个,其中PSMs值大于10的有8个,分别是KPNB1、NRAS、CD81、AP2M1、ITGA2、IGF2R、FN1、ACTC1。4.GO分类结果显示8个候选蛋白KPNB1、NRAS、CD81、AP2M1、ITGA2、IGF2R、FN1、ACTC1主要分布在细胞器膜或细胞膜上,并参与着重要的生理生化作用。结论1.透射电子显微镜、Western blot、Nanosight结果显示改良超速离心法得到高纯度的细胞外泌体。2.肝癌细胞外泌体的蛋白表达谱不同于正常肝细胞外泌体的蛋白表达谱,肝癌细胞外泌体高表达但正常肝细胞外泌体不表达的8个蛋白KPNB1、NRAS、CD81、AP2M1、ITGA2、IGF2R、FN1、ACTC1,均为细胞器膜或细胞膜蛋白,作为下一步研究的候选膜蛋白。第二部分肝癌细胞外泌体特异表达膜蛋白的验证目的对相对定量蛋白表达图谱数据分析筛选出的8个候选膜蛋白进行验证,分析其在肝癌组织、肝癌细胞、肝癌细胞外泌体中mRNA和蛋白表达水平及与预后的关系,为外泌体膜蛋白研究提供新的角度和思路。方法1.培养HL-7702、HepG2、Huh7、Hep3B细胞,提取total RNA后利用qRT-PCR对8个候选膜蛋白KPNB1、NRAS、CD81、AP2M1、ITGA2、IGF2R、FN1、ACTC1的mRNA表达水平进行验证。2.培养HL-7702、HepG2、Huh7、Hep3B细胞,提取细胞总蛋白,对候选膜蛋白ITGA2、IGF2R在肝癌细胞中的蛋白表达水平进行验证。3.对HL-7702、HepG2、Huh7、Hep3B细胞进行计数种板,培养12h后利用免疫荧光验证两个候选膜蛋白ITGA2、IGF2R在HL-7702、HepG2、Huh7、Hep3B细胞中的分布位置及表达情况。4.培养HL-7702、HepG2、Huh7、Hep3B细胞,改良超速离心法分离纯化细胞外泌体,提取细胞外泌体总蛋白,对候选膜蛋白ITGA2、IGF2R在肝癌细胞外泌体中蛋白表达水平进行验证,筛选出本研究的目的膜蛋白IGF2R。5.利用基因表达谱数据动态分析网站(GEPIA)、OncoLnc网站和癌症基因组图谱(TCGA)数据库,分析IGF2R在肝癌组织中的表达水平及对肝癌患者生存率的影响。6.对目的膜蛋白IGF2R在其他肿瘤细胞中的表达情况进行分析:提取前列腺癌PC-3细胞、神经母细胞瘤SH5Y细胞total RNA,利用qRT-PCR对IGF2R mRNA表达水平分析;提取PC-3、SH5Y细胞总蛋白,Western blot实验对细胞中IGF2R的蛋白表达量进行分析。结果1.qRT-PCR结果显示,相比HL-7702正常肝细胞,5个蛋白KPNB1、NRAS、CD81、ITGA2、IGF2R的mRNA表达水平在不同的肝癌细胞HepG2、Huh7、Hep3B中均呈现高表达(P<0.05),且候选膜蛋白ITGA2、IGF2R在Hep3B肝癌细胞中的表达量尤为显著,IGF2R(HL-7702 vs Hep3B,1.000±0.000 vs 7.875±1.009,P=0.000)、ITGA2(HL-7702 vs Hep3B,1.016±0.024vs 5.842±1.122,P=0.002)。2.细胞Western blot结果显示,相比HL-7702正常肝细胞,候选膜蛋白IGF2R在Huh7、Hep3B肝癌细胞中的蛋白表达量分别为0.936±0.310(P=0.029),1.577±0.551(P=0.012),IGF2R在肝癌细胞中表达增高;候选膜蛋白ITGA2在Huh7、Hep3B肝癌细胞中的蛋白表达量分别为1.591±0.372(P=0.028),1.690±0.542(P=0.021),ITGA2在肝癌细胞中表达增高。3.细胞免疫荧光结果显示,相比HL-7702正常肝细胞,候选膜蛋白ITGA2、IGF2R在HepG2、Huh7、Hep3B肝癌细胞中均有表达,且IGF2R在肝癌细胞中的表达量较高,特别是在Hep3B肝癌细胞中尤为显著。4.细胞外泌体Western blot结果显示,相比候选膜蛋白IGF2R在HL-7702正常肝细胞外泌体表达量0.179±0.066,其在Huh7、Hep3B肝癌细胞外泌体中的蛋白表达量增高,分别为1.044±0.153(P=0.009),1.174±0.088(P=0.001);相比候选膜蛋白ITGA2在HL-7702正常肝细胞外泌体表达量0.888±0.106,其在Huh7、Hep3B肝癌细胞外泌体中的蛋白表达量增高,分别为1.502±0.234(P=0.014),1.921±0.234(P=0.000)。5.结合以上实验结果,将IGF2R作为本研究的目的膜蛋白,经过关键词IGF2R搜索,GEPIA网站数据显示,与癌旁组织相比,IGF2R在肝癌组织中显示出高表达,Onco Lnc网站中的Kaplan-Meier生存曲线表明在IGF2R肝癌患者高表达组中的生存率明显低于低表达组(P=0.022)。6.与正常肝细胞或肝癌细胞相比,目的膜蛋白IGF2R在PC-3、SH5Y细胞中均有表达,其m RNA的表达量均低于正常肝细胞(HL-7702 vs SH5Y:1.000±0.008 vs 0.000±0.000,P=0.000;HL-7702 vs PC-3:1.000±0.008 vs0.473±0.270,P=0.000)和肝癌细胞Hep G2(Hep G2 vs SH5Y:1.3546±0.197vs 0.000±0.000,P=0.000;Hep G2 vs PC-3:1.3546±0.197 vs 0.473±0.270,P=0.020)、Huh7(Huh7 vs SH5Y,3.069±0.250 vs 0.000±0.000,P=0.000;Huh7 vs PC-3,3.069±0.250 vs 0.473±0.270,P=0.000)、Hep3B(Hep3B vs SH5Y,7.542±1.218 vs 0.000±0.000,P=0.000;Hep3B vs PC-3,7.542±1.218 vs 0.473±0.270,P=0.001);与正常肝细胞或肝癌细胞相比,目的膜蛋白IGF2R在PC-3、SH5Y癌细胞中均有表达,但其蛋白表达量均低于肝癌细胞Hep3B(Hep3B vs PC-3,1.372±0.128 vs 0.263±0.007,P=0.000;Hep3B vs SH5Y,1.372±0.128 vs 0.502±0.044,P=0.000)。结论1.IGF2R在肝癌细胞中mRNA表达水平、蛋白表达水平均上调;2.IGF2R在肝癌细胞外泌体中蛋白表达水平上调;3.IGF2R高表达预示肝癌患者较低生存率;4.IGF2R在大多数肿瘤中均有一定的表达,但在Hep3B这类肝癌细胞中显著增高,可作为重要的分离其外泌体的工具蛋白。