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研究背景和目的:UFM1(ubiquitin-fold modifier 1)是近年来发现的一种类泛素蛋白,它具有类似于泛素的修饰功能,即类似泛素分子可以共价结合到其它靶蛋白上,这种现象称为ufmylation。目前已知ufmylation在内质网应激、细胞稳态等方面具有重要的作用,并与许多疾病相关,如缺血性心脏病、髋关节发育不良、癌症等。另外据报道在乳腺癌中,当17β-雌二醇存在时,连接在E3(UFL1)上的UFM1必须通过UFBP1的介导才能连接到被修饰底物ASC1(Activating signal cointegrator 1)上,UFBP1(UFM1-binding and PCI domain-containing protein 1,也称为DDRGK domain-containing protein 1)是UFM1已知的修饰底物,这不仅说明ufmylation可能具有两种不同的修饰途径,而且也说明UFBP1在ufmylation中具有重要的功能。因此,本论文一方面通过非标记定量蛋白质组学谱图计数法鉴定UFBP1的相互作用蛋白来探究其潜在的生物学功能;另一方面,通过蛋白质组学方法探究UFM1修饰路径的具体分子机制;基于已有的研究,UFM1修饰系统只发现一个E1(UBA5)、一个E2(UFC1)、一个E3(UFL1)以及两个底物蛋白ASC1和UFBP1。因此,本论文还将通过构建融合蛋白和定量蛋白质组学的方法鉴定UFM1潜在的修饰底物。研究方法:构建FLAG-UFBP1质粒并在HEK293T细胞中过表达,通过免疫纯化获取UFBP1相互作用蛋白,胰酶酶解后得到肽段进行质谱检测,经过数据库搜索和相互作用蛋白的生物信息学和相互作用网络分析,发现UFBP1相关的生物学功能并通过免疫印迹方法验证部分相互作用;构建Myc-Strep-UFL1质粒并在HEK293T细胞中过表达,通过亲和纯化得到UFL1相互作用蛋白,经质谱检测后,分析只与UFL1相互作用的蛋白和与UFL1、UFBP1共同作用的蛋白,通过免疫印迹方法鉴定UFM1修饰底物,并探索UFM1修饰路径的具体分子机制;构建FLAG-UFC1-UFM1和其突变体FLAG-UFC1-UFM1 G83X质粒并在HEK293T细胞中过表达,通过免疫纯化获得UFM1修饰底物,TMT试剂标记后通过质谱检测分析得到潜在的修饰底物,并通过免疫印迹方法进行验证。研究结果:通过非标记定量蛋白质组学的谱图计数法分析鉴定得到214个UFBP1相互作用蛋白,通过蛋白相互作用网络分析发现UFBP1与其相互作用蛋白能形成复杂的相互作用网络,通过KEGG信号通路分析发现UFBP1与蛋白酶体的许多亚基相互作用,通过生物化学实验发现UFBP1对其相互作用蛋白的稳定性具有三种不同的调控方式:稳定性下降、不变或上升,其中发现UFBP1引起其相互作用蛋白稳定性下降极有可能是通过泛素-蛋白酶体途径所介导的降解来实现的;通过质谱分析得到94个UFL1相互作用蛋白和18个UFL1、UFBP1共同相互作用蛋白,通过免疫印迹实验验证了部分相互作用蛋白;融合蛋白FLAG-UFC1-UFM1的表达可以提高UFM1对底物蛋白的修饰程度,通过FLAG树脂免疫纯化后得到潜在的UFM1修饰底物。研究结论:通过定量蛋白质组学、生物信息学和生化实验发现UFBP1不同于ufmylation修饰系统的新功能,UFBP1对其相互作用蛋白的稳定性具有三种不同的调控方式。通过实验表明,UFBP1引起其相互作用蛋白稳定性降低极有可能是通过泛素-蛋白酶体途径所介导的降解来实现的,而UFBP1生物学功能研究的不断深入也会使我们进一步了解UFM1修饰系统的功能;通过构建融合蛋白的方法研究UFM1修饰路径的具体分子机制以及UFM1修饰底物蛋白,都将为研究UFM1修饰路径及其潜在的生物学功能提供重要的基础。