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研究目的:Poly C binding protein 1(PCBP1)是一种分子质量约为38 KD的核苷酸结合蛋白,广泛参与细胞内的基因表达调控,主要包括前体m RNA的剪接、成熟m RNA稳定性以及m RNA翻译的增强或沉默等。目前研究表明PCBP1可能是一种抑癌基因,在结直肠癌、肺癌、宫颈癌、乳腺癌和肝癌组织中表达下调,且其表达下调与上述肿瘤的发生进展密切相关。卵巢癌作为女性三大恶性肿瘤(包括卵巢癌、宫颈癌、子宫癌)中最凶险的恶性肿瘤,其发病机理还不十分清楚。PCBP1作为一个可能的抑癌基因,但关于PCBP1与卵巢癌的发生是否相关还不清楚,其具体的抑癌机制也还不十分清楚,急需进一步的深入研究。最近,越来越多的研究表明细胞自噬与肿瘤的发生发展以及转移耐药等密切相关。一般认为,在肿瘤发生初期,肿瘤血管还未生成,肿瘤细胞往往处于一种营养匮乏和缺氧的状态下,此时肿瘤细胞主要是依靠细胞自噬产生维持其正常代谢和生长的必需营养物质如核苷酸、氨基酸和脂肪酸等。与此同时,肿瘤细胞过度的细胞自噬又会导致自噬性细胞死亡。因此,本文试图探讨PCBP1在卵巢癌发生中的分子功能及其潜在的作用机理:首先我们在临床卵巢癌样本中探讨PCBP1表达水平与卵巢癌发生进展的相关性;其次在营养匮乏条件下,探讨过表达PCBP1对肿瘤细胞生长存活和自噬诱导的影响,而后进一步阐明PCBP1又是如何调控细胞自噬发生和影响肿瘤细胞存活的分子机制;最后,再通过临床样本验证PCBP1表达失调与卵巢癌组织细胞自噬水平的相关性,以期为PCBP1表达缺失引起的肿瘤诊断和治疗提供新的治疗思路。研究方法:1.利用卵巢癌组织芯片其中包括90例卵巢癌组织和10例卵巢癌癌旁组织进行免疫组织化学(IHC)研究PCBP1蛋白水平与卵巢癌发生进展的相关性;2.利用CCK8细胞增殖实验:首先研究无血清饥饿培养条件下,研究过表达PCBP1和自噬抑制剂氯喹(chloroquine,CQ)对A2780和DLD-1肿瘤细胞增殖的影响;进一步利用Earle?s盐平衡液(Earle?s balanced salts solution,EBSS)饥饿诱导细胞自噬,再免疫印迹探讨过表达PCBP1对饥饿诱导细胞自噬过程中LC3B蛋白表达及其I型向II型转换的影响;3.细胞自噬流量研究,首先利用EBSS饥饿诱导细胞自噬和CQ抑制自噬体降解,再应用蛋白免疫印迹和细胞免疫荧光实验技术,研究PCBP1对LC3B,p62蛋白水平和细胞自噬流量的影响;4.利用DMSO和放线菌素D分别处理细胞,8或12小时后提取总RNA,再进行反转录,然后用PCR的方法检测LC3B m RNA的量,以研究PCBP1对LC3B蛋白表达的改变是否通过影响LC3B m RNA稳定性而起作用;进一步使用细胞自噬降解抑制剂CQ处理细胞,进行蛋白免疫印迹,观察LC3B蛋白的表达水平变化,并进一步排除细胞自噬降解对LC3B蛋白表达的影响。5.利用EBSS饥饿处理或EBSS联合CQ处理情况下,通过显微镜拍照观察统计和应用流式细胞凋亡检测技术检测过表达PCBP1对肿瘤细胞死亡数目和比例的影响;同样在EBSS饥饿处理或EBSS联合CQ处理压力条件下,通过蛋白免疫印迹检测过表达PCBP1对C-Caspase 8、C-Caspase 3和C-PARP以及Bcl-2蛋白表达水平的影响,进而在分子机制水平验证过表达PCBP1和细胞自噬抑制对肿瘤细胞凋亡的影响;6.应用相应连续切片的卵巢癌组织芯片,利用免疫组织化学(IHC)进一步检测细胞自噬降解底物SQSTM1/p62,并观察SQSTM1/p62和PCBP1表达水平的相关性,以进一步在卵巢癌临床样本中明确PCBP1与细胞自噬的关系。研究结果:1.首先我们证实了PCBP1在92.2%的卵巢癌临床组织样本中普遍的表达下调或不表达(p<0.0001),且其表达下调程度与卵巢癌的肿瘤分期(p<0.0062)、临床分期(p<0.0317)以及转移(p<0.0177)均呈正相关;2.过表达PCBP1在无血清培养条件下显著抑制了在肿瘤细胞A2780和DLD-1的生长(p<0.001)。有趣的是,在无血清培养条件下,通过细胞自噬抑制剂CQ处理,可以完全模拟PCBP1过表达造成的肿瘤细胞生长抑制效应;3.进一步研究表明,在A2780和DLD-1肿瘤细胞中过表达PCBP1抑制了饥饿诱导的细胞自噬流量;相反,利用特异性的sh RNA敲低PCBP1促进了饥饿诱导细胞自噬的流量。从机制方面显示,PCBP1能够抑制细胞自噬核心基因LC3B基因m RNA的稳定性及其蛋白表达,导致细胞自噬抑制;4.同时还表明,在营养匮乏条件下,过表达PCBP1通过上调C-Caspase 8、CCaspase 3和C-PARP活化形式以及下调抗细胞凋亡蛋白Bcl-2的表达,促进肿瘤细胞凋亡;5.IHC检测SQSTM1/p62结果显示,细胞自噬降解底物SQSTM1/p62在卵巢癌组织中同样显著表达下调(p<0.002),但与卵巢癌的进展无显著相关性(p>0.2);SQSTM1/p62与相应的PCBP1蛋白表达水平呈显著正相关(相关系数R2=0.506,p<0.01),进一步在卵巢癌临床组织样本中验证了PCBP1抑制肿瘤细胞自噬的生理功能;结论:本论文证实PCBP1在临床卵巢癌组织样品中表达下调,且在临床上进一步验证PCBP1表达下调与卵巢癌组织的细胞自噬水平以及卵巢癌的发生进展密切相关,进一步揭示了PCBP1表达下调通过增加细胞自噬相关基因LC3B m RNA稳定性和其蛋白表达,诱发细胞自噬,促进肿瘤细胞在饥饿条件下的存活的分子机制。