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核酸开关（Riboswitch）是一类天然存在的RNA传感元件和基因调控因子，其通常与体内一系列小分子代谢物互作，随即促发mRNA非编码区（5端）应答性变构而调控基因表达过程。多数学者认为，核酸开关介导的基因表达调控是一种古老的分子调控模式，无需蛋白质协助。迄今为止，已发现的核酸开关主要来源于低等生物群落，尚未在人类体内发现类似的功能结构单元。 目前，S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine, SAM）核糖开关家族的研究最为广泛。SAM核糖开关是迄今发现的最大核糖开关家族，因其结合同一配体“SAM”而得名，它包含SAM-Ⅰ～SAM-Ⅴ五种亚型， S-box（SAM-Ⅰ）、SMK（SAM-Ⅲ）两个亚型的研究较为深入，而SAM-Ⅳ、SAM-Ⅴ结构与功能信息却知之甚少。SAM核糖开关各亚型结构和来源各异，甚至调控机理也不尽相同。广泛的生化、结构和遗传学研究已建立了核糖开关在生命体内发挥功能的基本原理，这对开发抗生素、设计新型分子传感器、以及将核糖开关整合进合成回路具有重要的指导意义。 本课题主要集中在SAM-Ⅳ的结构和功能研究上。首先，利用核酸结晶测试技术获取SAM-Ⅳ与相应调控分子互作的三维结构信息，本阶段主要完成多种SAM-Ⅳ RNA结晶体制备，为后续结晶测试奠定基础。本研究工作是基于“天蓝色链霉菌”（Streptomyces coelicolor,Sc），“金黄节杆菌”（Arthrobacter aurescens,Aau），“节杆菌”（Arthrobacter sp.，Asp）等野生型菌株的SAM-Ⅳ基因结构进行优化设计，通过构建体外高效转录系统，经诱导转录获取转录本（SAM-Ⅳ RNA），再经分离纯化和回收获取高纯度样品，以备结晶测试之用。其次，基于SAM-Ⅳ RNA进行SHAPE分析。SHAPE分析结果显示，SAM的存在使SAM-Ⅳ的RNA二级，三级结构及预测的结合核心结构更加稳定，同时SAM的结合依赖于P5部分的参与。推测其存在SAM依赖性分子调控机制，从而为SAM-Ⅳ核酸开关调控机理研究奠定了基础。整体工作分为三部分，具体如下： 1. SAMⅣ RNA制备与结晶 首先，基于野生型SAM-Ⅳ RNA序列信息进行模板优化设计，其主要原则：1）保留核心功能区，剔除部分非功能区，并将部分非致死位碱基A，U突变为稳定性更高的碱基G，C；2）在构型两侧插入丁型肝炎病毒核酸酶（HDV ribozyme）及锤头状核酶（Hammerhead ribozyme）序列，以便于获取准确的目的片段。 随后，由上海生工合成部代理合成优化模板序列，构建重组质粒。再经PCR扩增技术获取大量SAM-Ⅳ优化模板，进而利用构建好的体外转录体系经高效转录获取足量RNA，在转录体系中由于核酶的自剪切作用，将目的序列准确切下，经由变性尿素-聚丙烯酰胺凝胶（Urea-PAGE）将产物分离纯化，通过胶回收后转入超滤离心管将目的样品进一步纯化，获得高纯转录本。而后将纯化所得RNA样本经重折叠后，由悬浮蒸汽扩散法（hanging drop vapor diffusion method）获得并筛选晶体。在实验中，初步测试了晶体条件，获得了部分SAM-Ⅳ晶体。 2. SAM-Ⅳ结构优化及SHAPE分析 根据不同种菌体的SAM-Ⅳ核糖开关设计不同的突变构型，并对用于SHAPE分析的核糖开关结构进行优化，以甄别各部分的功能及核糖开关作用机理。SAM-Ⅳ RNA准备同前，由生物公司合成并插入质粒，得到pUC57_SAM-Ⅳ_SHAPE模板，再经PCR、体外转录、胶分离纯化回收等步骤获得高纯样本RNA。最后通过SHAPE分析实验及测序仪分析得知SAM的存在使SAM-Ⅳ RNA折叠及整体三维结构更加稳定，同时精确定位了SAM-Ⅳ RNA与SAM的结合位点。而且还揭示了SAM的结合依赖于SAM-Ⅳ构型中P5部分的参与，推测其分子调节的机制跟P5部分有直接关系。 3.体外转录体系优化 优化体外转录体系，旨在高效获取RNA产物。体外转录被广泛用于分子生物学及结构生物学。鉴于一般转录RNA产量较低，故针对其部分条件进行优化，包括镁离子补加时间，镁离子补加浓度，NTP加入浓度，NTP补加浓度，反应总时间及无机焦磷酸酶等几个方面。实验中利用所掌握的资料及专业知识确定影响因素并设计正交实验，再通过方差分析，多重比较等方法得到了优化结果，即补加时间，M g2+补加浓度，反应总时间，无机焦磷酸酶的添加等方面不对结果造成影响，属次要因素，NTP补加浓度为20mM/L，NTP加入浓度为25mM/Lamp;nbsp;时，RNA产量提升了300％。 本课题旨在利用晶体测试及SHAPE分析对SAM-Ⅳ核糖开关的结构和功能进行研究。同时，还对体外转录体系进行优化，提升了RNA的产量。实验中通过优化SAM-Ⅳ核糖开关的结构，利用结晶测试获得了部分 RNA晶体，且经 SHAPE数据分析，得知 SAM能够稳定SAM-Ⅳ的整体结构，并且准确定位了SAM-Ⅳ的SAM结合位点，同时发现P5在SAM的结合过程中有重要作用。并且经正交实验分析确定体外转录体系中当NTP补加浓度为20mM/L，NTP加入浓度为25mM/L时，RNA产量获得了3倍提升。这些研究为SAM-Ⅳ核糖开关的结构与机理有了进一步了解，加深人们对SAM核糖开关家族乃至核糖开关的认知。