薤白多糖提取、分离提纯及与DNA作用研究

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薤白系百合科葱属植物小根蒜Allium macrostemon Bunge或薤A. chinese G. Don的干燥鳞茎。薤白味辛、苦,性温,具有理气、宽胸、通阳、散结的功效,中医长期用于治疗胸闷刺痛、肺气喘等疾病。薤白耐旱、耐瘠、耐低温、适应性很强,是一种药食两用的粗放型经济作物,而且在我国资源丰富,其具有重要的开发前途。现代研究表明,薤白具有抗肿瘤、抗衰老等作用,已分离得到挥发油、皂苷、前列腺素、含氮化合物等化学成分,但其多糖研究鲜见报道。本文主要研究了薤白多糖的酶法提取工艺、分离提纯、及对分离所得组分进行纯度鉴定、分子量测定、理化性质分析,并用荧光探针法研究了薤白多糖与DNA的作用。研究结果如下:’纤维素酶法提取薤白多糖的工艺研究中,通过单因素实验和L9(34)正交实验,研究了酶解温度(A)、酶解时间(B)、酶解pH值(C)、酶添加量(D)对薤白多糖提取率的影响。结果表明:四个因素对多糖提取率影响的主次顺序为D>C>A>B,酶添加量和酶解pH值为主要因素。最佳提取工艺A2B3C2D3,即酶解温度50℃,酶解时间2.5h,酶解pH值5.0,酶添加量0.4%。薤白多糖的提取率为17.27%。水提法时薤白多糖的提取率为12.78%,纤维素酶酶解辅助提取法优于水提法。薤白粗多糖经蛋白酶加Sevag法除蛋白,H202法脱色,透析袋透析纯化后得多糖半纯品(AMP). H2O2法脱色工艺条件为H2O2浓度10%,温度60℃,恒温反应4h。薤白多糖半纯品先后采用超滤、DEAE-32纤维素柱层析、Sephadex G-100凝胶柱层析进一步分离纯化。先经超滤得两个组分,即AMP-ⅠAMP-Ⅱ c AMP-Ⅰ AMP-Ⅱ再分别经过DEAE-32纤维素柱层析得到AMP-Ⅰa、AMP-Ⅰb两种级分和AMP-Ⅱa、 AMP-Ⅱb、AMP-Ⅱe三种级分。其中AMP-Ⅰa、AMP-Ⅱb、AMP-Ⅱc进一步用SephadexG-100凝胶柱层析纯化,经高效液相色谱法鉴定AMP-Ⅰa、AMP-Ⅱb为均一的多糖。本实验选定该两种均一多糖为深入研究对象。高效液相色谱法鉴定AMP-Ⅰa、AMP-Ⅱb的平均分子量分别为1.86×105Da、6.43×104Da。 AMP-Ⅰ a为白色粉末,AMP-Ⅱb为淡黄色粉末,两者均溶于水。以溴化乙锭(EB)为荧光探针,研究了薤白多糖与DNA的作用。不同类型薤白多糖在同等浓度(0.1mg/ml)下,与DNA相互作用常数从大到小依次为:AMP-Ⅱb24.49%>AMP-Ⅰa20.90%>粗多糖10.38%>粗多糖(未除蛋白)5.31%,表明薤白多糖纯度越高,与DNA相互作用越强,证明薤白多糖是一种与DNA有相互作用的活性成分。薤白多糖的浓度与DNA作用的强弱有直接关系,在一定范围内,AMP-Ⅱb与DNA作用的较佳浓度为0.2975mg/ml。
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