κ-卡拉胶是从多种海洋红藻中提取的一种水溶性硫酸酯多糖，能形成硬的脆性胶，凝固性好，粘度低，工业上应用广泛，适合做果冻、固定化酶载体、药用硬胶囊等。天然提取的κ-卡拉胶凝胶强度比较低，需要通过改性提高其凝胶强度。目前，国内外普遍采用高温（70～90℃）碱改性（10%以上NaOH/KOH）生产高凝胶强度κ-卡拉胶，存在胶质得率低，耗碱量大，能耗高，环境污染严重等缺点。生物技术的迅速发展，使生物酶催化成为解决工业生产中节能、环保问题的有效手段。D-半乳糖-6-硫酸化酶改性可以提高κ-卡拉胶的凝胶强度，目前关于该酶的研究比较少，并且对酶改性作用机理的研究未见报道。本课题首先从不同种类海洋红藻中筛选高活性D-半乳糖-6-硫酸化酶，通过提取分离纯化获得电泳纯硫酸化酶，对该酶的稳定性及酶学特性进行全面研究，应用该酶改性制备高凝胶性能κ-卡拉胶，并对其作用机理进行深入研究。主要结果如下：通过筛选发现异枝麒麟菜为富含D-半乳糖-6-硫酸化酶活力的原料，酶活以μ-卡拉胶计为10.87±0.39U/g，并且92.6%硫酸化酶酶活存在于可溶性组分中，膜组分酶活回收率仅为7.4%。通过优化异枝麒麟菜硫酸化酶提取方法，分析得出了较佳提取条件为：采用液氮冷冻研磨法破碎细胞，提取溶液为50mM pH8.5Tris-HCl缓冲液（含10mM2-巯基乙醇和0.5M KCl），提取时间为6h，料液比为1:3。在此条件下，提取得到的硫酸化酶活力为6.92U/mL，蛋白质含量为0.165mg/mL。异枝麒麟菜硫酸化酶稳定性研究表明，硫酸化酶对储存pH十分敏感，最佳保存pH为7.0，另外，硫酸化酶粗酶液中加入10mM2-巯基乙醇可以在4℃下保存7天而维持酶活基本不变。在-20℃的储存温度下，添加10%甘油（v/v）的粗硫酸化酶溶液在保存10天后，酶活力基本没变，存放20天后维持80%的残余酶活。添加5%蔗糖（w/v）的硫酸化酶经过冷冻干燥后维持98.65%的残余酶活，并且在-20℃下储存40天酶活力基本没有变化。硫酸化酶为热敏感酶，添加甘氨酸和蔗糖可以提高硫酸化酶的热稳定性，在50℃下保温6h，酶液可分别维持65%和60%的初始酶活。添加蔗糖的冻干酶粉，经硫酸铵沉淀、Phenyl-Sepharose6Fast Flow疏水作用层析和DEAE-Sepharose CL-6B离子交换层析进行分离纯化。获得的硫酸化酶在SDS-PAGE电泳图上显示为单一条带，分子量约65kDa，凝胶排阻色谱法测得的分子量约50kDa，表明异枝麒麟菜硫酸化酶是单亚基蛋白。该酶的最适反应pH为7.0，最适反应温度为40℃。对于其最适底物μ-卡拉胶，Km值为4.31mM，Vmax值为0.17mM min1。化学修饰结果表明丝氨酸、赖氨酸、半胱氨酸为硫酸化酶活性中心关键氨基酸。EDTA、SDS对该酶酶活影响不大，说明此酶是非金属离子结合酶。采用100U/kg异枝麒麟菜硫酸化酶改性制备κ-卡拉胶，凝胶强度达到1457.4g/cm2，提高了6.78倍，并且酶法改性改善了κ-卡拉胶质构，提高了其粘度、凝固点、融点等凝胶性能。对酶改性后的κ-卡拉胶进行脱色处理，研究表明大孔阴离子交换树脂D303脱色效果明显，添加量为0.16g/mL时，脱色率为90.73%，凝胶强度为1803.7g/cm2。作为对比研究，对传统碱改性工艺进行优化，较佳工艺条件为：乙醇浓度为20%、碱浓度为3%、改性时间为2h、改性温度为75℃。通过对比发现，酶法改性制备得到的κ-卡拉胶凝胶性能优于碱改性κ-卡拉胶，并且在环境保护方面有明显优势，因此，酶法改性可以替代传统碱改性工艺制备高凝胶性能κ-卡拉胶。红外吸收光谱和1H/13C核磁共振图谱分析得出，海南异枝麒麟菜卡拉胶以κ-卡拉胶为主，同时还有少量ι-卡拉胶和β-卡拉胶。通过对D-半乳糖-6-硫酸化酶改性作用机理的研究表明，酶法改性可以将μ-卡拉胶半乳糖残基上的C-6硫酸酯基脱除转变成κ-卡拉胶中的3,6-内醚键桥，使其构象转化成螺旋亲和型，从而使κ-卡拉胶分子间相互交联增多，形成更加致密和有序的蜂窝状网络结构，进而提高κ-卡拉胶凝胶强度。