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第一部分mTOR信号通路负调控的自噬在饥饿早期保护多发性骨髓瘤细胞抵抗凋亡目的：本研究利用饥饿诱导多发性骨髓瘤细胞同时发生自噬和凋亡,观察两者的生物学特征以及相互关系,探讨所涉及的分子机制,明确饥饿时多发性骨髓瘤细胞中自噬的生物学特征。方法：在正常培养基中培养多发性骨髓瘤RPMI8226细胞至对数生长期,然后完全去除培养基内的胎牛血清诱导细胞饥饿状态。利用3-甲基腺素(3-Methyladenine,3-MA)抑制自噬。利用MTT比色法检测经实验处理后细胞的增殖活性。分别利用以下技术检测经实验处理后的细胞内的自噬水平：MDC(monodansylcadaverine)荧光染色剂荧光标记自噬并用流式细胞术测定荧光强度,western blot免疫印记技术检测自噬标记蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC3)Ⅰ向LC3Ⅱ的蛋白转化水平以及Beclin 1蛋白表达水平,RT-PCR和qRT-PCR检测Beclin 1的mRNA水平,利用透射电镜(TEM)直接观察自噬小体的形成和数量。利用Annexin V-FITC/PI流式细胞术和TUNEL检测细胞凋亡,利用TEM直接观察胞内凋亡的典型形态学变化。利用western blot免疫印记技术S6K1的磷酸化水平、活化caspase 3蛋白水平、Bax从胞浆向线粒体的转位水平。分别利用RT-PCR和quantitative RT-PCR(qRT-PCR)检测Beclin 1和Bax的mRNA水平。利用SPSS13.0进行统计分析,p<0.05具有统计学差异。结果：饥饿诱导多发性骨髓瘤细胞发生自噬,自噬在饥饿6h,12h和18h呈现时间依赖性上升,自噬在18h达到最高水平,随后在24h和48h出现下降,并在48h回落至基础水平,该过程受mTORCl通路的负性调控；饥饿诱导细胞发生随时间时间逐渐上升的凋亡,并在饥饿24h自噬出现下降时凋亡显著增加,伴随凋亡的Bax转位和caspase 3活化说明饥饿诱导细胞发生线粒体依赖的典型凋亡：3-MA抑制自噬后,饥饿6h,12h和18h的细胞凋亡和caspase 3活化增加,而24h和48h两者无明显变化。结论：饥饿能同时诱导RPMI8226细胞发生自噬和凋亡；自噬主要发生在饥饿早期并抑制凋亡的发生保护肿瘤细胞生存,随着饥饿的持续,细胞最终走向凋亡；凋亡为RPMI8226细胞死亡的主要方式；mTORCl通路参与了自噬的调控。第二部分饥饿诱导多发性骨髓瘤细胞发生时间依赖的自噬和凋亡的分子机制探讨目的：前文已经证实了饥饿同时诱导多发性骨髓瘤细胞系细胞发生自噬和凋亡；自噬与凋亡呈现时间依赖性的变化,饥饿0h,6h,12h,18h时自噬和凋亡呈现时间依赖性增加,其中自噬增加明显,而凋亡增加较轻微,而饥饿24h和48h自噬下降,与此同时凋亡爆发：同时发现自噬受mTORC负调控,而凋亡则是caspase-3介导Bax依赖的经典凋亡途径。本研究的目的是进一步探讨其细胞分子信号机制。方法：用qRT-PCR和RT-PCR检测了饥饿0h、6h、12h、18h、24h和48hDeptor、Raf-1、JNK1、JNK2、JNK3、p53、p21以及NFκB1的转录水平；利用SPSS13.0统计分析数据。结果：在RPMI8226细胞中Raf-1、JNKl、JNK2、NFκB1和p21高度表达,Deptor和p53中度表达,JNK3低度表达。Deptor转录水平与自噬变化一致在0h、6h、12h和18h呈现时间依赖性升高继而在24h和48h下降；Raf-1、JNK1、JNK2、p53、p21转录水平与凋亡变化一致在0h、6h、12h、18h、24h和48h呈现时间依赖性升高,24h和48h增加更为明显；NFκB1各时间点转录水平较0h下降但并未呈现时间依赖性。结论：上述信号分子均参与了饥饿时细胞反应,Deptor主要促进细胞自噬,Raf-1/JNK/p53/p21与细胞凋亡密切相关,而NFκB1抑制细胞凋亡。Deptor是否同时参与调控了细胞自噬和凋亡仍有待证实。第三部分冬凌草甲素诱导多发性骨髓瘤细胞发生自噬和凋亡的机制研究目的：本实验主要研究冬凌草甲素诱导多发性骨髓瘤发生自噬、凋亡,两者之间的关系以及所涉及的相关机制。方法：利用MTT比色法检测冬凌草甲素对多发性骨髓瘤RPMI8226细胞的增殖活性影响；透视电镜观察细胞内凋亡和自噬的形态学改变；Annexin V-FITC/PI流式细胞术和TUNEL检测细胞凋亡；分别利用以下技术检测处理后的细胞内的自噬变化：使用QDs605nm-Anti-LC3荧光探针以及免疫荧光技术定位细胞胞内LC3Ⅰ和LC3Ⅱ蛋白,利用western blot免疫印记技术检测LC3Ⅰ向LC3Ⅱ转化水平；利用DCFH-DA探针以及流式细胞术检测细胞胞内ROS水平；western blot免疫印记技术检测细胞active caspase 3和Beclin 1表达水平以及SIRT1核蛋白表达水平。结果：冬凌草甲素能明显抑制RPMI8226细胞增殖,其抑制作用呈时间、剂量依赖性；冬凌草甲素能同时诱发呈时间依赖性升高的凋亡和自噬,然而,caspase3依赖的凋亡是冬凌草甲素诱导细胞死亡的主要方式；与此同时,冬凌草甲素诱导呈时间依赖性的细胞胞内ROS水平升高以及SIRT1核蛋白表达下降；用NAC完全抑制胞内ROS产生后,冬凌草甲素无法再诱发凋亡和自噬,也逆转了冬凌草甲素对SIRT1核蛋白水平的抑制；3-MA抑制自噬后,细胞凋亡增多,胞内ROS产生进一步增多而SIRT1核蛋白水平进一步下降。结论：冬凌草甲素能明显抑制RPMI8226细胞增殖；冬凌草甲素能同时诱发RPMI8226细胞自噬和凋亡；胞内ROS产生通过下调SIRT1舌性介导冬凌草甲素诱导的凋亡和自噬；胞内ROS产生下调SIRT1活性。凋亡为细胞死亡的主要途径,而自噬抵抗凋亡促进细胞生存。