目的:探讨缺氧环境下雷公藤甲素(Triptolide,TP)对人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)中缺氧诱导因子1α(HIF1α)和血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。在人近曲肾小管上皮细胞(Human kidney proximal tubular epithelial cell,HK-2)中,研究TP对TGF-β1诱导的上皮-间充质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)的影响,从而探讨TP对肾脏纤维化过程的影响及其可能的分子机制。方法:为了研究TP在缺氧情况下对HIF1α和VEGF表达的影响,(1)我们选取原代人脐静脉内皮细胞培养于专门的缺氧培养小室中。实验所做的分组及处理如下:HUVECs加入0、40、80、160、320 nmol/L的TP(分别设为缺氧组,TP40组、TP80组、TP160组、TP320组)在缺氧条件下(37℃、5%CO2、1%O2、94%N2)培养12 h,同时设常氧组(不加TP)作为对照,Western blot检测各组HIF1α蛋白表达。(2)细胞设TP80组、缺氧组和常氧组,免疫荧光法检测HIF1α在细胞中的表达定位。(3)设TP80组和缺氧组,处理结束后Western blot检测VEGF蛋白表达水平。(4)加入HIF1α的抑制剂KC7F2,设缺氧组、TP80组,TP80+KF20组(80 nmol/L TP和20μmol/L KC7F2)、TP80+KF30组(80 nmol/L TP和30μmol/L KC7F2),处理12 h后Western blot检测各组HIF1α、VEGF蛋白表达。为了研究TP在TGF-β1诱导的HK-2细胞EMT过程中的作用,(1)HK-2细胞的实验分组如下:1正常对照组,常规下培养细胞48h;2TGF-β1刺激组,10ng/ml的TGF-β1刺激细胞培养48h;3TP组,20μmol/L的TP加上10ng/ml的TGF-β1共同刺激培养细胞48h。每组实验重复一次,提取细胞的总RNA,纯化后以Illumina Hi Seq平台进行RNA测序。(2)分析处理转录组的测序信息,并与指定参考基因组进行序列比对,采用FPKM方法计算出单个基因在各个处理组中的表达量。(3)分析各处理组之间基因表达量的差异,找出上调基因和下调基因,并对差异表达基因的数目进行统计。(4)对差异表达基因进行KEGG的通路富集分析。(5)根据KEGG通路富集分析的结果,对TGF-β-smad信号通路进行蛋白表达水平的验证,实验的分组及处理条件如前述(1),相差显微镜来观察细胞形态的改变。(6)Western blot检测各种TGF-β-smad信号通路的相关指标(如smad2/3、TGF-βR?和TGF-βR??)的表达,同时也检测了EMT的相关指标(如E-cadherin、Vimentin和N-cadherin)的表达。结果:(1)常氧条件下HUVECs不表达HIF1α;缺氧条件下,TP可以诱导HIF1α的高表达,且TP浓度为80 nmol/L时,HIF1α的表达达到峰值,TP80组HIF1α表达水平较缺氧组明显升高(P<0.05),而TP160组和TP320组HIF1α表达与缺氧组相比无明显变化。(2)细胞免疫荧光结果显示,HIF1α主要表达于细胞核。(3)TP80组VEGF表达水平较缺氧组升高(P<0.05)。(4)TP作用后,TP80组较缺氧组HIF1α、VEGF表达水平都升高;但经过KC7F2干预后,TP80+KF20组和TP80+KF30组HIF1α、VEGF表达水平较TP80组明显降低(P<0.05)。(5)在NC、TGF-β1和TGF-β1+TP三个处理组中,计算出了14903个基因在不同处理组中的表达量(即FPKM值)。(6)通过对差异基因的两两比较,NC组与TGF-β1组比较,有161个上调基因和48个下调基因,NC组与TGF-β1+TP组比较中是2997个上调和1954个下调基因,而TGF-β1组与TGF-β1+TP组中,分析出的上调基因数为2982,下调基因数为1827个。TGF-β1+TP组与TGF-β1组比较中,火山图显示TP较TGF-β1处理引起更多基因的上调和下调。(7)差异表达基因在KEGG通路富集分析了两两比较中显著性Q值最小的前20个通路。其中Pathway in cancer富集最为显著,说明TP影响了肿瘤相关的通路,如TGF-β,Hippo等,多与细胞极性、EMT等过程有关。(8)在TGF-β1组与TP+TGF-β1组差异基因的KEGG富集通路TP影响了与许多与细胞粘附有关的通路,如TGF-beta signaling pathway、Hippo signaling pathway。在TGF-beta signaling pathway中Smad2/3、THBS1、Noggin、Rbx1、SARA、ROCK1和c-Myc的表达下调,伴随BAMB1和Smad5/8的上调。在Hippo signaling pathway通路中分析得到TP也下调Smad2/3的表达,但对E-cadherin的表达无影响。TP也影响了Pancreatic cancer通路中的许多基因的表达。(9)10ng/ml的TGF-β1刺激HK-2细胞,细胞形态从上皮铺路石样变成梭型,伴随TGF-β-smad信号通路蛋白Smad2/3、TGF-βR?、TGF-βR??和间充质的相关指标如N-cadherin、Vimentin蛋白表达上调,上皮特性的相关指标E-cadherin的下调。当TP的加入,TGF-β1+TP组与TGF-β1相比较,这些通路蛋白和间充质的指标都下调,但E-cadherin的表达却没有显著上调,细胞形态也未变成铺路石样,而是有些细胞开始变成圆形。结论:缺氧环境下TP可通过提高HIF1α来影响内皮细胞VEGF的表达。同时TP可能通过影响TGF-β-smad信号通路的相关基因的表达,对TGF-β1诱导的EMT有一定的抑制作用,TP与肾脏纤维化的治疗有关。