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目的:肿瘤的发生与细胞增殖失控、分化障碍及凋亡受阻密切相关,近年来与细胞增殖、凋亡有关的周期蛋白成为研究癌症发生的热点之一。细胞周期蛋白G2(cyclin G2)是新发现的周期蛋白G家族成员之一,与传统周期蛋白促进细胞增殖不同,其功能主要是抑制细胞周期的进程,甚至使细胞进入凋亡过程。目前关于cyclin G2在乳腺病变中的表达及其对乳腺癌MCF-7细胞的作用还未见相关报道。本实验旨在研究: (1)cyclin G2在乳腺病变中的表达及意义, (2)探讨cyclin G2对乳腺癌MCF-7细胞体外增殖的作用。
材料与方法:采用:(1)免疫组织化学染色(S-P法),观察Cyclin G2在人乳腺不同病变组织中的蛋白表达情况。(2)通过培养肾小管上皮细胞HK-2,获取总RNA,采用RT-PCR技术和基因克隆技术构建pDsRed2-Cyclin G2融合基因。(3)以脂质体法转染pDsRed2-Cyclin G2融合基因至人乳腺癌细胞系MCF-7细胞中,荧光显微镜下观察其蛋白在MCF-7中的表达和定位;并采用流式细胞术检测Cyclin G2对MCF-7细胞的作用。
结果:(1)Cyclin G2在正常乳腺组织、乳腺增生症、导管内癌(DCIS)以及浸润性导管癌(IDC)中的阳性表达率分别为90%、86.66%、56%、43.33%,CyclinG2在正常乳腺组织及乳腺增生症中的阳性表达率与表达强度均无差异(P>0.05):Cyclin G2在正常乳腺及乳腺增生组织中的阳性表达率均高于在DCIS中的表达(P<0.05),显著高于在IDC中的表达.(P<0.01),表达强度也显著高于DCIS和IDC中的表达强度(P<0.01); Cyclin G2在DCIS与IDC组织中的阳性表达率无明显差异(P>0.05),但其表达强度显著高于在IDC中的表达(P<0.01)。CyclinG2在IDC(LN+)、IDC(LN-)的阳性表达率分别为34.29%、56%,在IDC(LN+)组中的阳性表达率低于IDC(LN-)组(P<0.05),而表达强度无明显差异(P>0.05)。总的来说Cyclin G2在正常乳腺中有表达,在乳腺增生症中的阳性表达率及表达强度与正常乳腺组织相当,而在DCIS和IDC中的阳性表达率和表达强度逐渐下降。
(2)培养细胞HK-2,采用RT-PCR技术,获得了人类Cyclin G2的cDNA(525bp)。
(3)采用基因克隆技术构建了pDsRed2-Cyclin G2融合基因,通过PCR技术、酶切反应,证实其插入的片段与预知的相符。其融合蛋白在MCF-7细胞中的定位主要表现为弥漫性地分布在细胞核和细胞浆。(4)转染重组质粒pDsRed2-Cyclin G2于MCF-7细胞中,于48h后收集细胞,Annexin V-FITC染色和FCM检测,结果显示部分MCF-7细胞发生凋亡,FCM检测结果显示其细胞凋亡率为54.23%,高于未转染组(0.21%)及转空质粒pDsRed2-N1组(27.16%)(p<0.01)。
结论:(1)人正常乳腺组织中存在Cyclin G2蛋白表达,且阳性表达定位于乳腺导管上皮细胞胞浆;Cyclin G2在乳腺增生症中的表达与正常乳腺组织相似,而在乳腺癌中的表达较低或无表达。(2)IDC(LN+)组中Cyclin G2的阳性表达率低于IDC(LN-)组。 (3)成功地构建了pDsRed2-Cyclin G2融合表达质粒。其融合蛋白在MCF-7细胞中的定位为弥漫分布在细胞核和细胞浆。(4)pDsRed2-Cyclin G2融合蛋白能够促进MCF-7细胞的凋亡。