肠道病毒A型中的柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A 16,CVA16)和肠道病毒71型(Enterovirus 71,EVA71)是目前全球范围内引起手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)最主要的病原体,二者均为正链RNA病毒,在核苷酸序列和氨基酸序列上高度同源。近年来CVA16和EVA71发生基因重组且共流行加重了 HFMD的发病率和临床症状,已经上市的EVA71灭活苗并不能对CVA16起到交叉保护作用。N6-甲基腺苷酸(N6-methyladenosine,m6A)是腺嘌呤上第6位N原子发生甲基化修饰,在mRNA上主要分布于3’非编码区、翻译起始位点以及终止密码子上,可调控RNA的剪接、翻译和稳定性,在RNA代谢和功能中起到关键作用。目前已有研究发现EVA71的病毒基因组上存在m6A修饰,同时也证明了 m6A甲基化相关蛋白可调控EVA71的复制。但对CVA16感染后m6A修饰相关研究尚未报道。本研究首先选取了肠道病毒通过呼吸途径首要入侵的人呼吸道上皮细胞(16HBE细胞),分析CVA16和EVA71在16HBE细胞上的增殖动力学。接着探究病毒感染16HBE细胞、ICR乳鼠以及能表达人SCARB2受体的小鼠后,是否会影响m6A修饰中的甲基转移酶、去甲基化酶和甲基化阅读蛋白的表达,以及这些蛋白于正常状态下和感染病毒后在16HBE细胞中的定位。将CVA16和EVA71以MOI=0.1感染16HBE细胞,分别进行以下实验:(1)在感染后12h、24h和48 h收取样本进行感染性滴度测定(3次重复试验);(2)以未感染病毒的细胞作为Oh样本,Western Blot检测CVA16和EVA71感染后病毒结构蛋白VP1的表达;(3)采用免疫荧光技术检测CVA16和EVA71在16HBE细胞上的感染率;(4)采用免疫荧光技术和荧光共聚焦显微镜观察CVA16和EVA71感染后,m6A甲基转移酶、去甲基化酶以及甲基化阅读蛋白与VP1的单细胞共定位。PBS、CVA16和EVA71分别于颅腔注射1日龄ICR乳鼠,PBS组作为对照组,进行以下实验:(1)观察每日乳鼠发病情况,记录每天乳鼠死亡只数,绘制各组的生存曲线;(2)采用Western Blot检测ICR乳鼠脑组织中甲基转移酶、去甲基化酶和甲基化阅读蛋白的表达情况。PBS和CVA16分别滴鼻感染hSCARB2转基因小鼠,PBS组作为对照组。采用Western Blot检测hSCARB2转基因小鼠脑组织中m6A甲基化相关蛋白的表达情况。研究结果发现,(1)CVA16和EVA71均可在16HBE细胞上复制和增殖;(2)随着病毒感染时间的增加,在16HBE细胞中,m6A甲基化相关蛋白表达水平逐渐下调,同时这些蛋白可与病毒VP1共定位,在细胞核与细胞质中重新分布,甚至发生降解;(3)随着病毒感染天数的增加,在ICR乳鼠和hSCARB2转基因小鼠中m6A甲基化相关蛋白的表达无明显变化。结果说明,在16HBE细胞中,CVA16和EVA71感染对m6A甲基化相关蛋白的影响无明显差异,即:在宿主细胞中CVA16同样能够改变m6A甲基化修饰相关蛋白的表达和细胞定位。推测由于m6A修饰具有细胞特异性,且鼠脑组织中包含多种细胞类型,可能为导致在鼠脑组织中m6A甲基化相关蛋白无明显变化的原因之一。本研究结果提示m6A修饰可能成为下一个肠道病毒治疗的潜在靶点。