两种多溴联苯醚对褶皱臂尾轮虫生殖与发育毒性效应及其作用机制的初步研究

来源 :中国海洋大学 | 被引量 : 8次 | 上传用户:gqkhao
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多溴联苯醚(polybrominated diphenyl ethers, PBDEs)是一类在海洋环境中广泛存在的持久性有机污染物(persistent organic pollutants, POPs),对海洋环境和海洋生物的影响日趋严重。褶皱臂尾轮虫(Branchionus plicatilis)是一类重要的无脊椎海洋浮游动物,在海洋生态系统物质循环和能量流动中起着重要作用,并且是有机污染物进入海洋食物链的重要途径。但目前有关PBDEs对褶皱臂尾轮虫的研究还非常有限。因此,本研究选择在海洋环境和海洋生物体内广泛存在的BDE-47(tetrabrominated diphenyl ether-47, BDE-47)和BDE-209(decabrominateddiphenyl ether-209, BDE-209)为胁迫因子,首次将具有重要海洋生态学意义的褶皱臂尾轮虫为实验对象,从个体、组织、细胞、分子等不同生物层次上系统研究PBDEs急性与慢性胁迫对褶皱臂尾轮虫的生殖及发育毒性效应,并对可能的氧化应激(oxidative stress)作用机制进行了初步的探讨。研究的主要方法与结果如下:1.通过气相色谱-质谱联用法(GC-MS)方法对实验体系中BDE-47和BDE-209实际浓度的检测得出BDE-47和BDE-209的溶解浓度低于配制浓度,且BDE-209的溶解度远远小于BDE-47的溶解度。2.通过Log-probit方法分析得出BDE-47对褶皱臂尾轮虫24h-EC50值为7.923mg/L(95%confidence intervals,3.626~13.634mg/L);同样浓度下,BDE-209对褶皱臂尾轮虫没有发现半数抑制效应。3.0.2mg/L的BDE-47和BDE-209分别对褶皱臂尾轮虫胁迫24小时后,利用倒置显微镜观察到,两种同系物均会导致褶皱臂尾轮虫卵巢组织形态萎缩、脂质小滴数量减少,且BDE-47对卵巢产生的影响更为明显。4.以第一次产幼时间、最后一次产幼时间、产卵数、产幼数和产幼率等生理学指标作为褶皱臂尾轮虫生殖毒性检测指标在解剖镜下进行观测分析。与对照组相比,BDE-47和BDE-209各浓度组均能显著提前(P<0.05或P<0.001)褶皱臂尾轮虫的第一次产幼时间;BDE-47和BDE-209(0.1mg/L,0.2mg/L)可显著(P<0.05或P<0.001)提前褶皱臂尾轮虫的最后一次产幼时间;此外,各浓度的BDE-47能极显著(P<0.001)降低褶皱臂尾轮虫的产卵数与产幼数;0.1mg/L,0.2mg/L的BDE-47能极显著(P<0.001)降低褶皱臂尾轮虫的孵化率;但各浓度的BDE-209不但对这三项指标没有产生抑制效果,反而有微弱的促进作用。5.选择生殖前期、生殖期和生殖后期作为褶皱臂尾轮虫发育毒性生理学检测指标在解剖镜下进行观测分析。与对照组相比,BDE-47和BDE-209各浓度组均能显著缩短(P<0.01或P<0.001)褶皱臂尾轮虫的生殖前期;BDE-47(0.2mg/L)和BDE-209(0.1mg/L,0.2mg/L)可极显著(P<0.001)缩短褶皱臂尾轮虫生殖期;BDE-47(0.1mg/L,0.2mg/L)和BDE-209(0.2mg/L)可显著(P<0.01或P<0.001)缩短褶皱臂尾轮虫的生殖后期。6.通过筛选生殖与发育相关生理学指标进行因子分析(Factor Analysis, FA)得出:生殖期和最后一次产幼时间两项指标较于其他检测指标对BDE-47和BDE-209最为敏感;BDE-47与BDE-209独立分析结果显示,BDE-47对褶皱臂尾轮虫的毒性效应侧重于对成体阶段的生殖毒性,而BDE-209对褶皱臂尾轮虫的毒性效应则倾向于对幼体阶段的发育毒性。7.活性氧(Reactive oxygen species, ROS)和钙离子(Calcium ion, Ca2+)分别负载荧光探针DCFH-DA和Fluo-3/AM后,先通过荧光显微镜观察它们在褶皱臂尾轮虫体内的荧光强度及分布情况,然后使用Image-Pro Plus软件选定卵巢部位对其荧光值进行分析计算。与对照组相比,BDE-47(0.1mg/L,0.2mg/L)和BDE-209(0.2mg/L)能显著升高(P<0.01或P<0.001)卵巢细胞内ROS的水平以及Ca2+浓度([Ca2+])。8.通过实时定量PCR(Real-Time quantitative PCR,qRT-PCR)检测与生殖发育相关的vasa和nanos的基因表达,以及与氧化应激系统相关的sod、cat和cam的基因表达。与对照组相比,结果表明,BDE-47(0.2mg/L)能显著(P<0.01)激活sod的基因表达;BDE-47和BDE-209(0.2mg/L)能显著(P<0.01)激活cam的基因表达;但BDE-47和BDE-209对cat基因的表达水平均没有产生显著影响。得出的主要结论如下:1. GC-MS实验表明,BDE-47和BDE-209均难溶于水,且BDE-209的溶解度小于BDE-47的溶解度;2.急性毒性实验表明,BDE-47对褶皱臂尾轮虫的急性毒性大于BDE-209;3.基于形态学观察、生理学指标检测以及分子水平上对vasa和nanos基因表达的研究,表明褶皱臂尾轮虫对BDE-47和BDE-209胁迫非常敏感,且推断卵巢组织是BDE-47和BDE-209胁迫褶皱臂尾轮虫的作用靶器官。4.生殖与发育毒性效应实验表明,不论是具有较高毒性的低溴代联苯醚BDE-47还是具有较低毒性的高溴代联苯醚BDE-209都会抑制褶皱臂尾轮虫的生殖与发育,在个体水平以及分子水平均会产生生殖与发育毒性效应,且BDE-47较于BDE-209具有更强的生殖毒性与发育毒性;此外,低浓度的BDE-209还可能具有潜在的外源性雌激素(xenoestrogen)的作用。5. FA研究表明,在生殖与发育毒性的各项生理学指标中,生殖期和最后一次产幼时间对两种PBDEs的同系物均最为敏感,因此可作为生物标志物的候选指标。6.氧化应激作用机制的研究表明,BDE-47和BDE-209能引起褶皱臂尾轮虫卵巢组织细胞内ROS水平的升高,当ROS水平达到产生氧化胁迫的水平时,便会激活抗氧化系统(antioxidant system)中抗氧化酶sod和cat的表达以及影响Ca2+平衡和cam的表达水平,以期通过基于Ca2+信号通路的氧化应激作用机制的调控以消除或减弱BDE-47和BDE-209对褶皱臂尾轮虫造成的氧化胁迫。总之,本研究从急性毒性到慢性毒性,从个体水平到分子水平较为系统的评价了BDE-47和BDE-209对褶皱臂尾轮虫产生的生殖及发育毒性,并对其诱导的氧化应激作用机制进行了初步的研究,为PBDEs的海洋毒理生态学评价提供了一定的科学资料和理论依据。
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