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第7页,共120页玉米是我国主要的粮食作物之一,在保障国家粮食安全中起着重要作用。目前我国面临人口不断增加和耕地资源不断减少的双重压力,提高玉米产量和品质能有效的缓解粮食安全问题。生物与非生物胁迫,尤其是干旱、盐渍和高温等环境胁迫,严重威胁玉米生产。转录因子是能与真核生物基因启动子中相应的顺式作用元件特异结合的蛋白,通过它们之间以及与其他蛋白的相互作用激活或抑制靶基因的表达,在调控高等植物抵抗干旱、高盐、低温、高温、病原反应及发育等相关基因表达中起着重要作用。AP2/EREBP是植物特有的一类转录因子超家族,在植物的生长发育、新陈代谢和对逆境适应性方面起着不可替代的重要作用,但在玉米中有关ERF类转录因子功能研究还较少。本研究从玉米中克隆了参与乙烯信号转导的ERF类转录因子基因ZmERF1和EIN3/EIL家族基因ZmEIL1,对其进行了功能预测、转录激活活性、顺式元件结合活性、逆境胁迫响应以及不同发育时期胚乳中转录水平和蛋白质水平表达分析,同时将ZmERF1异源转化拟南芥进行功能研究。本研究不仅揭示了ZmERF1和ZmEIL1基因在逆境胁迫中的功能,同时也为进一步筛选优异玉米新种质、揭示玉米乙烯信号通路奠定了基础。主要研究结果如下:1.采用电子克隆和RT-PCR相结合方法从玉米自交系N04和丹232中克隆了一条全长cDNA序列,被命名为ZmERF1。在自交系N04中,该基因ORF全长687 bp,编码229个氨基酸;在自交系丹232中,该基因ORF全长690 bp,编码230个氨基酸,在两个自交系中该基因ORF存在5处插入、缺失和突变差异。ZmERF1编码蛋白含有一个典型的AP2结构域和一个双边核定位信号肽,与水稻OsERF和高粱SbERF具有较高同源性。洋葱表皮亚细胞定位表明该基因编码蛋白位于细胞核内,酵母实验证明该基因编码蛋白具有转录激活活性和GCC-box绑定功能,表明该基因是乙烯响应转录因子,属于AP2/EREBP家族的ERF亚家族。2.荧光定量PCR分析ZmERF1在自交系N04不同发育时期胚乳中的表达特征表明,该基因在胚乳发育早期和晚期的表达量较高;Western Blot检测表明该基因编码蛋白在胚乳发育早期和晚期的表达量也较高,这与不同发育时期籽粒的乙烯释放量相一致,因此推测该基因可能与玉米籽粒早期灌浆及后期脱水成熟有关。3.ZmERF1基因启动子序列分析表明,该启动子序列中含有抗逆、乙烯响应和ABA有关的顺式作用元件。对玉米四叶期的幼苗施加200 mM NaCl、20%PEG、37℃高温、4℃低温、100 mM ABA和喷施乙烯利等处理,根和叶片中ZmERF1基因可以被不同程度诱导表达,且表达模式不同。构建表达载体pCAMBIA1301-ZmERF1pro-GUS并转化拟南芥,GUS基因在转基因植株的嫩叶和花序中表达量较高,在胁迫处理下可以诱导表达,表明ZmERF1在非生物逆境胁迫中起重要作用。4.构建植物过表达载体pCAMBIA1302-ZmERF1并转化拟南芥,在45℃高温胁迫下转基因家系OE15的存活率达到53%,而野生型无一存活;在PEG处理下转基因株系的脯氨酸含量是野生型的2倍;在NaCl处理下,转基因植株的叶绿素含量为2.193 mg/g,明显高于野生型叶片的1.625 mg/g,这表明过表达ZmERF1能提高拟南芥的抗高温、抗渗透和抗盐胁迫能力。在正常条件下,转基因拟南芥的抗逆基因KIN2和RD29A、乙烯合成基因ACS2和ACS5以及ABA合成基因NCED5和SDR表达量明显高于野生型植株,表明ZmERF1异源表达后能高效激活下游抗性基因、ABA及乙烯合成基因的表达,并且经由ABA和乙烯信号转导途径来提高逆境胁迫抗性。5、采用电子克隆和RT-PCR相结合方法从玉米自交系N04和丹232中克隆了一个乙烯信号通路基因ZmEIL1,自交系N04中该基因ORF长1941 bp,编码647个氨基酸,自交系丹232中ORF长1944 bp,编码648个氨基酸,在两个自交系中该基因ORF存在2个氨基酸的变异和1个氨基酸位点的缺失;该基因编码蛋白含有5个BD区、5个α-helices和一段单边信号肽“GPPPYKKPHDLKKAW”,并且定位于细胞核中,与水稻中的OsEIL2亲缘关系较近。在玉米叶片和根中ZmEIL1可以被乙烯利诱导表达,表达量高于对照;在叶片该基因被1-MCP抑制表达,而根中表达量高于对照,表明该基因表达可以受外源乙烯的影响;在ZmERF1异源过表达的拟南芥植株中,拟南芥基因AtEIN3和AtEIL1呈现组成型的高表达,酵母双杂交系统中ZmERF1和ZmEIL1可以互作,这表明ZmEIL1是参与乙烯信号转导途径中的重要转录因子。