目的胚胎干细胞是一类来源于哺乳动物原始生殖细胞和囊胚内细胞团的全能细胞,主要具有两方面显著特征：一是具有体外高度增殖和自我更新的能力,二是可被定向诱导分化成体内各种细胞类型。孤雌激活来源的人胚胎干细胞的基因型与卵子提供者的基因型完全相同,由其诱导分化的细胞用于机体移植完全不会引起免疫排斥。因此,人胚胎干细胞尤其是人孤雌胚胎干细胞具有巨大的医学研究价值与应用前景,如再生医学、人类发育生物学和细胞治疗等。本实验旨在建立稳定的、标准化的人胚胎干细胞体外培养方法,并且在保证人胚胎干细胞长期稳定传代培养的基础上,比较不同饲养层对维持人胚胎干细胞生长的作用影响,从而优化人胚胎干细胞的培养条件。与此同时,对培养体系进行改良,利用废弃卵母细胞获得的孤雌囊胚在改良的完全人源性培养条件下建立最接近临床标准的人孤雌胚胎干细胞系,为临床级人孤雌胚胎干细胞研究与应用奠定基础。对象与方法本实验收集天津市中心妇产科医院生殖医学中心试管婴儿治疗患者的不成熟卵母细胞和移植后剩余无冻存价值的废弃胚胎,征得患者夫妇双方同意并签署知情同意书后用于本实验。应用人包皮成纤维细胞作为饲养层,85%KnockOut DMEM、15%KnockOut血清替代物、4ng/mlbFGF培养基,建立人胚胎干细胞系,并且对其特异性标志物SSEA-3、SSEA-4、SSEA-1、TRA-1-60、 TRA-1-81、转录因子Oct-4,碱性磷酸酶,体内或体外分化能力作全面的鉴定。同时,对小鼠胚胎成纤维细胞、人包皮成纤维细胞、人胚胎肺组织成纤维细胞三种饲养层的形态、性状、维持人胚胎干细胞生长能力如干细胞平均克隆形成数量、未分化克隆率进行比较,筛选出本实验室条件下最适合的人胚胎干细胞饲养层,并且应用这种饲养层细胞建立人孤雌胚胎干细胞系。应用不成熟人卵母细胞作为研究对象,体外培养成熟后,采用电脉冲联合6-DMAP孤雌激活及自发激活获得孤雌囊胚,同时改良人孤雌胚胎干细胞的培养体系,完全应用人源性培养基、人源性饲养层细胞,并且在操作中尽量减少异源性因素干扰,使建立的人孤雌胚胎干细胞系最大可能接近临床级应用标准。结果利用本实验室建立的人胚胎干细胞培养方法和改良的同源性培养体系,分别建立了人胚胎干细胞系H-TJ1、H-TJ2和人孤雌胚胎干细胞系P-TJ,体外长期扩增均超过30代,经鉴定分别保持人胚胎干细胞和人孤雌胚胎干细胞的特性。接种在三种饲养层上的人胚胎干细胞均可以维持克隆样生长,生物学鉴定均符合人胚胎干细胞标准,但不同饲养层上克隆的形态差异大。相比于两种人来源饲养层,小鼠胚胎成纤维细胞作为经典的饲养层可以获得最多的人胚胎干细胞克隆,而作为同源性饲养层细胞,人包皮成纤维细胞饲养层明显优于另两种饲养层细胞,能很好地维持人胚胎干细胞增殖和未分化状态。结论本研究成功建立了人胚胎干细胞和人孤雌胚胎干细胞培养体系,应用废弃胚胎和经体外成熟的M1、GV期卵母细胞分离得到了人胚胎干细胞系和人孤雌胚胎干细胞系,并且维持其人胚胎干细胞特性和人孤雌胚胎干细胞特性。人包皮成纤维细胞作为同源性饲养层细胞,不仅可以避免异源性污染并且可以维持人胚胎干细胞系在体外长期稳定传代。经过改良完全同源性的培养体系可以良好地维持人孤雌胚胎干细胞的性状和长期传代,本研究建立的人孤雌胚胎干细胞系接近临床级人胚胎干细胞系标准,为人胚胎干细胞系真正用于临床研究和应用打下了基础。