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研究背景：M型磷脂酶A2受体(The M-type phospholipase A2 receptor, M-type PLA2R,本文中简称PLA2R)是一种跨膜受体,能与分泌型磷脂酶A2 (secretory phospholipase A2, sPLA2)相结合。表达于人体肺脏、胎盘及肾脏等器官。足细胞是终末分化的上皮细胞,是肾小球滤过膜的重要组成部分。在肾小球疾病的发生发展中起着重要作用。正常人足细胞表达PLA2R,且在部分特发性膜性肾病(idiopathic membranous nephropathy, IMN)中表达增强。而啮齿类动物如兔、大鼠及小鼠的足细胞则基本不表达PLA2R。分泌型磷脂酶A2 IB(group IB secretory phospholipase A2, sPLA2 IB)除了其消化酶功能之外,研究证明还可以通过结合PLA2R介导细胞增殖、迁移、激素释放及类花生四烯酸物质的释放。此外,sPLA2IB还能介导神经细胞及巨噬细胞的凋亡。有趣的是,s PLA2 IB还在慢性肾功能衰竭病人中较对照组高约10倍水平。然而,PLA2R及sPLA2 IB在肾小球疾病的病理生理变化过程中的作用仍不清楚。本研究旨在探讨PLA2R在sPLA2 IB诱导足细胞凋亡中的作用以及可能的分子机制。为足细胞病理生理研究及PLA2R分子生物学功能的深入发掘提供理论依据。方法：第一部分：27例IMN患者按照血清sPLA2 IB及肾组织PLA2R表达水平分为sPLA IB低表达组(组I,<10 ng/ml,10例)和sPLA2 IB高表达组(组II,>10 ng/ml,17例)。各组患者经肾脏病理检查符合膜性肾病病理表现并排除继发性膜性肾病。在行免疫治疗前常规检测血压、临床生化指标及24h尿蛋白量。ELISA检测血清sPLA2 IB表达水平,TUNEL检测肾小球足细胞凋亡,免疫组化检测肾小球足细胞PLA2R表达情况。采用Pearson相关分析法探讨sPLA2IB、PLA2R表达量与肾小球足细胞凋亡间的相关性。第二部分：体外培养条件永生性人足细胞,未分化足细胞用含1X ITS(胰岛素,转铁蛋白及硒insulin, transferrin, and selenium)的培养基于33℃培养箱中传代培养,然后用不含ITS的培养基在37℃培养箱中诱导分化7-10天后应用于后续实验。药物干预前在无血清培养基中同步化12h后进行后续实验。(1)随机分组：10-6M sPLA2 IB刺激细胞不同时间组(0h、0.5h、1h、2h、6h)以及不同浓度组(0M、10-8M、10-7M、10-6M、10-5M) sPLA IB刺激细胞2h。(2)使用流式细胞术以及Hoechst-33342染色检测各组足细胞凋亡率。(3)Western blotting检测足细胞PLA2R的表达。(4)转染全长PLA2R质粒及PLA2R siRNA,观察各自对sPLA2 IB诱导足细胞凋亡的影响。第三部分：体外培养条件永生性人足细胞,未分化足细胞用含1X ITS(胰岛素,转铁蛋白及硒insulin, transferrin, and selenium)的培养基于33℃培养箱中传代培养,然后用不含ITS的培养基在37℃培养箱中诱导分化7-10天后应用于后续实验。药物干预前在无血清培养基中同步化12h后进行后续实验。(1)观察sPLA2 IB对足细胞磷酸化ERK1/2及胞浆型磷脂酶A2a (cPLA2a)表达改变和花生四烯酸(Arachidonic acid, AA)水平的影响。(2)转染PLA2R质粒及PLA2R siRNA,观察各自对ERK1/2 及 cPLA2a磷酸化水平及AA水平的影响。(3) ERK1/2特异性抑制剂U0126以及cPLA2a特异性抑制剂MAFP预处理足细胞,观察其对 sPLA2IB诱导足细胞凋亡的影响。(4)采用免疫共沉淀法研究cPLA2a与ERK1/2结合水平的变化。第四部分：体外培养条件永生性人足细胞,未分化足细胞用含1X ITS(胰岛素,转铁蛋白及硒insulin, transferrin, and selenium)的培养基于33℃培养箱中传代培养,然后用不含ITS的培养基在37℃培养箱中诱导分化7-10天后应用于后续实验。药物干预前在无血清培养基中同步化12h后进行后续实验。(1)随机分组：10-5MAA刺激细胞不同时间组(0h、0.5h、1h、2h、6h)以及不同浓度组(0M、10-8M、10-7M、10-6M、10-5M) AA刺激细胞2h。(2)使用流式细胞术以及Hoechst-33342染色检测各组足细胞凋亡率。(3)Western blotting检测足细胞p53的表达。结果：第一部分：(1)IMN患者血清sPLA2 IB低表达组与高表达组比较,年龄、性别、血压、血白细胞、血红蛋白、胆固醇及甘油三酯无统计学差异。(2)sPLA2 IB低表达组血清白蛋白较高表达组高,但24h尿蛋白量较高表达组低,差异有统计学意义(P<0.05)。(3) TUNEL显示,sPLA2 IB高表达组肾组织足细胞凋亡显著增加,与低表达组比较有统计学差异(P<0.05)。(4)Pearson相关性分析显示,血清sPLA2 IB及肾组织PLA2R水平分别与肾组织足细胞凋亡率呈正相关(r=0.744,P<0.05; r=0.527, P<0.05)。第二部分：(1)体外培养人足细胞表达PLA2R而小鼠足细胞几乎不表达PLA2R。(2) sPLA2 IB以时间和剂量依赖方式诱导人足细胞凋亡。(3)PLA2R质粒转染人足细胞显著增加sPLA2 IB诱导的足细胞凋亡(P<0.05)。(4)PLA2R siRNA转染人足细胞显著减轻sPLA2 IB诱导的足细胞凋亡(P<0.05)。第三部分：(1)sPLA2 IB对足细胞ERK1/2及cPLA2a磷酸化表达改变和AA水平影响呈时间和剂量依赖关系。(2)PLA2R质粒转染足细胞显著增加ERKl/2及cPLA2a磷酸化表达改变和AA水平(P<0.05)。(3)PLA2R siRNA转染足细胞显著下调ERK1/2及cPLA2a磷酸化表达改变和AA水平(P<0.05)。(4)U0126以及MAFP预处理足细胞,均可降低sPLA2 IB诱导的细胞凋亡率(P<0.05)。第四部分：(1)10-5M水平AA对足细胞p53表达改变影响呈时间依赖关系；10-6M以上水平AA对足细胞p53表达改变影响呈剂量依赖关系(P<0.05)。(2)10-5M水平AA对足细胞呈时间依赖关系诱导细胞凋亡；10-6M以上水平AA对足细胞呈剂量依赖关系诱导细胞凋亡(P<0.05)。结论：(1)sPLA2 IB在体内与足细胞凋亡相关、在体外能诱导足细胞凋亡。(2)sPLA2IB诱导足细胞凋亡通过PLA2R发生作用。(3)sPLA2 IB结合PLA2R后通过ERK1/2-cPLA2α- AA- p53通路诱导足细胞凋亡。