各种原因造成的尿道狭窄、尿道缺损仍然是泌尿外科的难题之一，临床上多采用包皮皮瓣、阴囊皮瓣、口腔黏膜、结肠黏膜等来重建尿道，其中，口腔黏膜是近年来广泛应用的修复材料，包括颊黏膜和舌粘膜，近年来在临床上被广泛应用且大量的临床结果表明修复效果良好。但口腔黏膜存在取材部位并发症、取材量受限等问题。组织工程技术的快速发展，为尿道重建提供了新的方法。其基本原理就是将具有生物活性的种子细胞与支架材料相结合，组成机体需要的、具有特定活性的替代材料以修复尿道缺损。但在组织修复过程中，尿道瘢痕的产生也是不可避免。如何既能保持口腔黏膜的修复功能，又不至于在修复的过程中不产生过多的瘢痕，一直是尿道修复领域中的重点和难点。目前尿道瘢痕过度增生的有效调控的基础研究正越来越受到学术界的重视，其中金属蛋白酶抑制因子—1(TIMP-1)的表达升高，可能是其胶原沉积增加的主要原因。反义TIMP-1寡核苷酸可抑制尿道瘢痕成纤维细胞TIMP-1的表达，增加胶原酶的活性，同时在高浓度时可抑制细胞的增殖，在胶原的降解和产生两方面发挥作用，减少了胶原在细胞外的沉积。因此抑制胶原合成、促进其降解是防止瘢痕形成的关键。由此我们设想，将口腔黏膜细胞接种于生物支架黏膜面的同时，将成纤维细胞接种于生物支架的底面，可构建更接近生理结构的组织工程口腔黏膜;与此同时，运用反义核酸技术，减少成纤维细胞胶原基质的过度合成和分泌，则既可充分利用成纤维细胞的修复创伤的作用，又可防止术后瘢痕的发生，从而极大改善重建尿道黏膜修复的效果。本研究探讨应用成纤维细胞转染反义TIMP-1寡核苷酸，以口腔上皮细胞复合小肠粘膜下层脱细胞基质构建组织工程口腔黏膜来重建尿道的可行性，探讨金属蛋白酶抑制因子—1(TIMP-1)在组织工程修复尿道瘢痕愈合过程中的作用，不至于产生过度瘢痕，以期为组织工程黏膜修复尿道提供理论和实验依据，全文共分四章:　　第一章种子细胞的培养和鉴定　　1目的　　探讨犬成纤维细胞(fibroblasts，FB)、口腔上皮细胞(oralkeratinocyte，OK)分离、体外培养增殖及鉴定方法。　　2材料和方法　　应用胶原酶消化法分离培养犬成纤维细胞，倒置显微镜观察，同时进行免疫细胞化学鉴定和半乳糖苷酶染色。结果分离的成纤维细胞可在体外快速生长、增殖。波形蛋白免疫细胞化学染色95％以上为阳性。　　应用DispaseⅡ分离犬口腔上皮层，胰酶消化分离获得犬OK，在i3T3滋养细胞培养基扩增，免疫荧光检测细胞AE1/AE3的表达，获得足量细胞后利用流式细胞仪检测细胞表面AE1/AE3的表达率。　　3结果　　原代培养3天后可见成纤维细胞贴壁生长，约5天左右细胞融合可达80-90％，可传代培养。倒置相差显微镜下可见长梭形细胞生长，苏木素-伊红染色可见细胞呈漩涡状、平行排列，第5代细胞免疫荧光检测波形蛋白(vimentin)表达阳性。　　OK原代培养3天后可见贴壁生长，约15天左右细胞融合达到80-90％。显微镜下见OK呈多角形，细胞融合后呈典型的“铺路石”状外观。传代后将P1OK接种至丝裂霉素灭活的3T3(i3T3)培养基培养、扩增，可见OK细胞呈集落样生长，约6天细胞融合达90-94％。流式细胞仪检测P3OKAE1/AE3表达率为87.4％。　　4结论　　利用胶原酶消化法可获得一定量的成纤维细胞，来源广泛，获取简单，并且创伤小。成纤维细胞形态一般呈长梭形细胞生长，苏木素-伊红染色可见细胞呈漩涡状、平行排列，第5代细胞免疫荧光检测波形蛋白(vimentin)表达阳性。　　DispaseⅡ能将犬口腔上皮表皮层脱离，将表皮层粉碎后用胰酶消化，能获得大量OK，方法简单，创伤小。OK呈扁平、多边形，形状不规则，细胞融合后呈典型的“铺路石”状外观。细胞生长缓慢，2-3代后即衰老变性。在i3T3培养基上，OK表现出旺盛的增殖力，细胞生长迅速，能保持7-8代稳定增殖。流式细胞检测表明，P3OK中AE1/AE3表达率达到87.4％。　　第二章犬成纤维细胞Timp-1基因的提取与鉴定　　1.目的　　通过犬成纤维细胞的培养，筛选出具有高的siRNA干扰力的TIMP-1转染基因。　　2.方法　　将成纤维细胞裂解后先行RNA提取，用分光光度计测定抽提的RNA浓度和纯度。去除样品中DNA污染，在去除了DNA污染的RNA样品中加入oligo(dT)18primer1μL，进行cDNA第一链合成。合成后的cDNA样品-20℃保存。最后进行Realtime-PCR。　　3.结果　　取相对定量的方法检测目的基因的表达变化，按照2-△△CT岍法对数据进行分析处理。　　4结论　　在犬成纤维细胞中含有siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3、不含siRNA和对照组的TIMP基因的干扰力分别为49.57％、15.03％、-49.34％、12.78％和0.00％。含siRNA-1干扰基因的TIMP-1具有较高的干扰力。　　第三章小肠粘膜下层脱细胞基质(SIS)的制备、与含TIMP基因的成纤维细胞和OK体外构建组织工程口腔粘膜的实验研究　　1目的　　探讨SIS的生物相容性，以及与成纤维细胞和OK体外构建组织工程口腔粘膜的可行性。　　2方法　　将猪小肠清洗后，钝性去除粘膜层和浆肌层，获得小肠粘膜下层，以1％的Triton-X100与0.1％NH3H2O脱细胞，以1∶1的甲醇/氯仿脱脂处理，反复冲洗后行冻干，密封包装后以25kGy的剂量行Co60辐照灭菌。将所得的SIS行HE染色、Masson染色观察有无细胞残留及胶原纤维形态，扫描电镜观察材料表面的纤维分布和表面特点。将SIS浸泡于DMEM培养液中1周，取浸泡DMEM液培养ADSC，绘制生长曲线，观测SIS浸泡液对细胞增殖速率的影响，以此评估SIS的生物相容性。　　将成纤维细胞种植到SIS上，3天后将成纤维细胞-SIS翻转置于不锈钢网上，反面种植OK，用混合培养基在液-气平面培养OK-SIS-成纤维细胞复合物7天，行扫描电镜观察细胞在支架上的生长，HE染色观察该组织工程复合物的组织学特点，与OK-SIS作对比，观察成纤维细胞的存在对新生上皮的影响。　　3结果　　HE染色和Masson染色表明所得SIS无细胞残留，保持完整的胶原纤维成分。扫描电镜下SIS表面胶原纤维呈现裂隙样结构，利于细胞的黏附、长入。　　扫描电镜结果表明，成纤维细胞和OK均能在SIS表面良好黏附、生长。HE染色表明，与OK-SIS对比，OK-SIS-FB复合物表面上皮层结构更为致密、更为厚，上皮层形态更好。　　4结论　　SIS生物相容性良好，FB和OK均能在其表面良好生长。成纤维细胞的存在也利于体外培养环境下新上皮层的形成，利用SIS、OK和成纤维细胞体外构建组织工程口腔黏膜是可以试验的。　　第四章组织工程化OK-SIS-成纤维细胞复合物用于犬尿道重建的实验研究　　1目的　　探讨组织工程化OK-SIS-成纤维细胞复合物在尿道重建的可行性，以及重建尿道后的瘢痕生长情况。　　2方法　　分别采用单纯的SIS及组织工程化OK-SIS-成纤维细胞复合物对雌性Beagle犬行5cm长尿道黏膜替代修补，剥除5cm尿道黏膜后，将修复材料缝合于尿道床上，与两端正常尿道黏膜缝合，留置8号导尿管。术后3周拔除导尿管，在术后5、9、13、17、21、25周进行尿道造影，25周后行组织学检测。　　3结果　　SIS重建尿道组术后5周尿道造影显示修复段发生尿道狭窄，瘢痕组织增生明显，该组1只犬在术后7周死于尿潴留继发感染。OK-SIS-成纤维细胞复合物重建尿道组3只犬，其中1只犬成活良好至试验结束，各时间点尿道造影均显示修复段尿道保持通畅，另2只犬实验中发生意外而死亡。术后25周取存活犬，组织学染色表明修复段形成复层上皮结构。　　4结论　　利用SIS、OK和成纤维细胞构建组织工程化OK-SIS-成纤维细胞复合物能够管状修复犬5cm长尿道粘膜缺损，转染的TIMP基因有可能调控瘢痕的过度增生;单纯SIS管状修复5cm尿道缺损后会造成修复段尿道瘢痕过度增生，从而引起修复段尿道狭窄。