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目 的:对中华眼镜蛇毒和烙铁头蛇毒进行抗补体活性筛选,以期从中发现新的抗补体蛋白,并对其分离纯化、理化性质和抗补体活性加以研究,对其可能的应用前景加以评价。
研究方法:1.采用SP Sephadex C-25离子交换柱层析和RP-HPLC从中华眼镜蛇(Naja atra)蛇毒中分离纯化目标蛋白;采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和MALDI-TOF-MS对目标蛋白的表观分子量、精确分子量和纯度进行测定;等电聚焦电泳法测定等电点;Edman降解法对其N端序列进行部分测定;测定目的蛋白对补体经典途径和替代途径溶血的抑制活性;采用绵羊红细胞、豚鼠红细胞和兔红细胞测定目标蛋白的溶血活性;采用MTT法测定对肿瘤细胞K562细胞株的抗肿瘤作用,SRB法测定对肿瘤细胞A549和MCF-7细胞株的抗肿瘤作用;采用KB平板扩散法测定抗菌活性;测定目的蛋白对经典途径C3转化酶形成的影响,判断其可能的作用机制。
2.采用Q Sepharose Fast Flow阴离子交换柱层析、SP Sephadex C-25阳离子交换柱层析、Sephacryl S-200凝胶柱层析、1ml Hitrap SP HP、1ml Hitrap SP HP、1ml Hitrap Heparin HP和Superdex 75凝胶柱层析对国产烙铁头蛇(Trimeresurus mucrosquamatus)蛇毒中的抗补体成分进行分离,并同时测定各初分峰的纤维蛋白原水解活性及精氨酸酯酶等生物活性。
结 果:1.从中华眼镜蛇毒中分离出一个新的抗补体蛋白,精确分子量为7kD,等电点为9.81;N端序列结果表明与细胞毒素有较高的同源性;抗补体活性测定表明,它对正常人血清补体经典途径的激活抑制作用较明显,而对替代途径抑制作用较弱,同时对豚鼠和大鼠血清补体经典途径的激活抑制不明显,机制研究表明,主要通过抑制经典途径中C3转化酶形成达到抗补体作用。而溶血测定表明对绵羊红细胞和兔红细胞都没有溶血作用,对豚鼠红细胞有轻微的溶血作用;同时对K562、A549、MCF-7细胞株有抑制作用;对枯草芽孢杆菌和藤黄微球菌的生长有抑制作用;
2.对烙铁头蛇毒中的抗补体活性成分进行了初步的分离。其中粗毒经Q Sepharose Fast Flow离子交换层析后的分离峰中,峰1具有抗补体活性;峰1~6具有纤维蛋白原水解活性、精氨酸酯酶活性、水肿活性;峰1~4具有出血活性、峰1、3~6有抗凝活性。
结 论:1.两种蛇毒中均存在抗补体活性成分。
2.从中华眼镜蛇毒中首次分离纯化出一个分子量为7kD的新的抗补体蛋白,它对补体的抑制作用呈现一定的种属依赖性,对正常人血清中补体经典途径的抑制作用较明显,而对豚鼠和大鼠血清中补体经典途径的抑制不明显。通过对其理化性质和生物学活性的研究,为进一步的深入研究提供了依据和参考,同时,对其开展结构与功能的研究也有助于抗补体肽类药物的设计,具有潜在的应用价值。
3.通过对烙铁头蛇毒中抗补体活性成分的分离条件的摸索以及粗分峰多种生物活性的测定,为下一步从烙铁头蛇毒中分离纯化出抗补体蛋白打下了前期工作基础;为从烙铁头蛇毒中寻找新的功能蛋白或药物分子提供参考依据。