在许多生物实验中,常常需要以高分辨率进行显微成像,并确保实验样品图像在数小时或数天内保持对焦的状态,这对于高放大倍数的生物显微镜来说,实现起来具有一定的挑战性:生物显微镜机械结构的热不稳定性和空气的热波动都可能导致焦点漂移。除此之外,对于不平坦的实验样本,需要对每一个观察的位置重新对焦,依靠人工长时间保持实验样本不离焦,不太现实。因此,本文立足于上述需求,基于对焦深度法的显微镜自动对焦方案,设计并实现了一套高放大倍数,高对焦调节精度的生物显微镜自动对焦控制系统。该系统是以生物显微镜作为硬件平台,其主要硬件设备包括高分辨率CCD相机,压电控制器和3轴位移平台。基于上述硬件设备而定制的软件操作系统,人机交互界面简洁,系统设计遵循高内聚、低耦合的基本原则,提高了系统的稳定性及可维护性。本文的自动对焦系统实现过程如下:通过CCD相机采集一系列位移平台沿Z轴移动时对应的显微镜样品图像,通过清晰度评价函数对这些图像进行分析,计算出最清晰图像所对应的位移平台Z轴的位置,并将该位置对应的电压值反馈给压电控制器,使得位移平台的Z轴在压电控制器的作用下,带动样品移动到该位置,从而实现显微镜自动对焦的功能。我们发现在上述的实现过程中,存在以下问题:位移平台的Z轴以固定值移动,当该值较小时,CCD相机采集的样品图像较多,相邻图像间清晰度较为接近,可能导致图像清晰度评价函数陷于局部极值点,延长系统处理时间,甚至对焦失败;当该值较大时,将导致对焦系统位移平台调节精度不够。为了有效地解决上述问题,本文提出了改进后的拉普拉斯清晰度评价函数以及搜索寻优算法,将两者相结合后应用于生物显微镜自动对焦系统中。我们的实验结果表明,本文改进后的清晰度评价函数在三组生物实验标本中,函数评价值归一化后的曲线尖锐性较好,有利于搜索寻优算法的实现,减少位移平台反复运动次数,提高对焦效率。在100倍物镜的成像条件下自动对焦时间平均控制在1.23 s内,可重复性高,对焦调节精度可以达到200 nm,基本上能够满足实际使用的需要。