目的:神经母细胞瘤(Neuroblastoma,NB)具有高度异质性,能从自行消退到病情迅速进展,尤其对于高危组神经母细胞瘤患者,即使通过多模式高强度的治疗,其总生存率仍低于40%,预后较差。而这必然与其独特的分子生物学复杂性密切相关,因此基于基因分子改变对神经母细胞瘤患者进行预后分层以及靶向治疗或许是解决上述难题的绝佳选择。其中MYCN基因扩增是神经母细胞瘤患者不良预后判断的最佳指标,然而,超过60%的神经母细胞瘤患儿却缺乏此改变,大部分患者的预后分组以及靶向治疗尚缺乏可依据的基因变异指标。可见对神经母细胞瘤基因病因学的探究迫在眉睫。方法:随着高通量测序技术的发展,其中靶向捕获二代测序技术(Next Generation Sequencing,NGS)因其高通量、高效的特点在很多疾病的基因探索中得到了广泛应用。本研究即利用该技术,通过选定与NB发生及预后密切相关的基因位点进行靶向捕获,最终制定了覆盖53个基因全外显子及3个大的基因拷贝数变异(Copy Number Variation,CNV)区域,共212948bp大小的神经母细胞瘤检测模板。然后应用此模板,对33例经FISH验证MYCN(-)的神经母细胞瘤患者的新鲜肿瘤组织以及配对的外周血白细胞进行了靶向深度测序。利用SPSS19.0软件对测序结果和临床资料进行统计分析,以P<0.05定义为差异具有统计学意义。结果:对33例神经母细胞瘤二代测序数据进行质量控制分析,结果显示,所有样本测序深度平均为887×,最大和最小测序深度分别为1376×和438×;另外,去除重复读段后的测序深度平均为474×(合格为大于100×)。极高的测序深度使我们更准确的发现变异结果。绝大多数样品的靶向捕获率非常集中在70%附近(合格为大于40%),说明该模板的捕获效率很好。对33例神经母细胞瘤患者深度测序后共发现17个体细胞变异,涉及14个基因,其中主要的改变形式为拷贝数变异(CNV):包括发生在8个病人的13个拷贝数变异(2个CDK4扩增、2个CCND1扩增、1个OS9扩增,1个MYCN扩增,1个DDX1扩增;1个11q缺失、1个CDKN1C缺失、1个CDKN2A缺失、1个H19缺失、1个RBMS3缺失以及1个TIAM1缺失);还包括4个点突变:2个ALK突变(p.F1174L)、1个BRCA2突变(p.K2392N),以及1个PHOX2B突变(p.F86fs)。未见基因融合。其中,TIAM1基因在神经母细胞瘤中发生缺失是我们所检测出的新的变异。根据有无发生拷贝数变异,将33例神经母细胞瘤患者分为CNV(+)和CNV(-)两组。这两组在病理组织学预后分型(International Neuroblastoma Pathology Classification,INPC)、神经母细胞瘤INSS分期(International Neuroblastoma Staging System,INSS)以及远处转移中存在明显差异(P=0.002、P=0.024和P=0.038),CNV(+)与INSS 4期、UH以及存在远处转移正相关。CNV(-)患者的3年无事件生存率(EFS)为60.0%,而CNV(+)患者为16.7%(P=0.015,HR=0.1344,95%,CI=0.027~0.678)。此外,发生CNV的患者对常规化疗的治疗反应较差(P=0.059)。结论:本研究开发了神经母细胞瘤基因检测模板,并通过全面质控分析,验证其捕获效率高,测序数据具有较高的可靠性。对33例神经母细胞瘤患者进行靶向二代测序后,发现体系突变中以CNV为主。CNV与其他不良预后因素,即组织学预后不良型(Unfavourable Histology,UH)、INSS 4期以及存在远处转移正相关,且发生CNV的患者3年无事件生存率明显降低,对常规化疗耐受,这些均提示CNV与NB预后不良相关。其中TIAM1基因的缺失为新发现的变异,其可能参与调控神经母细胞瘤分化过程,它的发现为进一步NB发病机制的研究奠定基础。大部分发生CNV的基因参与细胞周期调控,提示CDK4/CDK6抑制剂可用于这类NB患者的靶向治疗。因此,基于神经母细胞瘤检测模板对患者进行深度测序,可促进NB患者预后判断以及靶向治疗,并为NB发病机制的研究奠定基础。