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第一部分BBD9抑制骨髓瘤细胞生存并诱导细胞凋亡目的:观察BBD9对多发性骨髓瘤细胞生存的影响及其机制。方法:MTT法检测BBD9对多种骨髓瘤细胞株及原代细胞的生长抑制作用,瑞氏染色观察细胞形态学变化,AV-PI法检测细胞凋亡,检测DNA ladder,流式细胞术检测细胞周期,western blot法检测caspase,BCL-2家族蛋白及细胞周期调控蛋白。结果:在0~4μg/ml BBD9作用下,BBD9能显著抑制四种骨髓瘤细胞株(RPMI8226、U266、MM.1S、MM.1R)的生长。随着BBD9浓度的升高,各细胞株的细胞存活率逐步降低。此外,BBD9对四种细胞株的生长抑制作用也呈时间依赖性,同一浓度下,药物作用时间越长,细胞存活率也越低。BBD9作用于RPMI8226、U266、MM.1S、MM.1R细胞24h的IC50依次是:2.30μg/ml、1.87μg/ml、2.39μg/ml、1.54μg/ml。BBD9对3例病人原代细胞也呈现剂量依赖性的生长抑制。BBD9处理骨髓瘤原代细胞24h的IC50为1.08μg/ml。用正常骨髓单个核细胞进行MTT检测发现,在0-4μg/ml BBD9也呈剂量依赖性地抑制正常骨髓单个核细胞的生长,但其对药物的敏感性低于原代细胞,24h的IC50为3.24μg/ml。形态学观察可见,BBD9处理24h后的U266细胞和RPMI8226细胞出现了典型的凋亡细胞形态:核碎裂,凋亡小体。DNA片段化检测可见经BBD9处理的RPMI8226细胞出现了典型“DNA梯子”,随着药物浓度的增加,“DNA梯子”也越明显。AV-PI法检测细胞凋亡也发现,BBD9可以诱导骨髓瘤细胞出现凋亡。0、1、2、3μg/ml BBD9处理RPMI8226细胞24h后,早期凋亡细胞比例分别为1.57±0.37%、4.79±2.47%、16.18±5.45%、42.94±13.99%;而在U266细胞,早期凋亡细胞的比例分别为2.69±1.28%、7.36±2.22%、19.67±2.83%、50.26±16.29%。BBD9还可以诱导U266细胞和RPMI8226细胞caspase-3,-8,-9及PARP剪切激活。进一步的检测可见,BBD9处理后,促凋亡蛋白Bak、Bax和Bim表达量在U266和RPMI8226细胞均有明显升高,抑凋亡蛋白Mcl-1明显下调。但是,另外两种重要的抑凋亡蛋白BCL-2和BCL-XL则变化不明显。此外,对细胞周期分析表明,BBD9使骨髓瘤细胞周期阻滞在G2/M期。0、1、2、3μg/ml BBD9处理24h后,处于G2/M期的RPMI8226细胞分别为4.49±3.79%、13.61±2.09%、41.03±2.09%、35.99±9.05%;而处于G2/M期的U266细胞分别为14.14±0.6%、19.48±2.84%、26.54±3.44%、33.62±3.0%。细胞周期调控蛋白cyclinA、cyclinB1在BBD9处理的RPMI8226细胞和U266细胞中均明显下调,而CDK1及P27无明显改变。结论:(1)BBD9能抑制多种骨髓瘤细胞株及原代细胞生长。(2)BBD9诱导骨髓瘤细胞凋亡。(3)BBD9上调促凋亡蛋白Bak、Bax和Bim,下调抑凋亡蛋白Mcl-1。(4)BBD9通过下调cyclinA、cyclinB1使细胞周期阻滞于G2/M期。第二部分BBD9诱导的凋亡伴随着FOXO3a/Bim途径激活目的:研究BBD9诱导的Bim蛋白表达上调的机制。方法:Real-time PCR检测Bim mRNA及mir-17-5p的表达,western blot分析细胞核内FOXO3a及pFOXO3a表达量,免疫荧光显微镜观察FOXO3在细胞内的分布。结果:BBD9处理U266细胞8h后,Bim mRNA拷贝数明显增加。与此同时,对BimmRNA起负调控作用的成熟体小RNA—mir-17-5p明显下调。3μg/ml BBD9处理时,mir-17-5p下降至未处理组的0.35±0.23倍。Westem blot结果显示,BBD9处理的U266细胞核内Bim基因转录因子FOXO3a的表达量较未处理的U266细胞明显升高。与此相反,核内pFOXO3a蛋白量随着BBD9浓度的增加而减少。免疫荧光显微镜下可以看到:在BBD9处理前,U266细胞胞核内FOXO3a表达较低,胞浆内FOXO3a表达相对较高;而在2μg/ml BBD9处理24h后,U266细胞胞核内FOXO3a的荧光较强,而胞浆中FOXO3a则较弱。同样地,在BBD9处理前,RPMI8226细胞胞核内FOXO3a荧光较弱,胞浆内FOXO3a荧光则相对更强;而在2μg/mlBBD9处理24h后,RPMI8226细胞胞核内FOXO3a的荧光较强,而胞浆中FOXO3a则较弱。结论:(1)BBD9通过提高胞核内FOXO3a的表达量,促进Bim基因转录,增加BimmRNA拷贝数,从而导致Bim蛋白表达上调。(2)BBD9还通过下调mir-17-5p,减少Bim mRNA降解或对Bim mRNA翻译的抑制,从而使Bim蛋白表达上调。第三部分BBD9抑制IL-6信号传导途径的激活目的:通过观察IL-6信号传导途径中参与信号转导的各种分子的改变,进一步阐明BBD9诱导的骨髓瘤细胞凋亡的分子机制。方法:MTT检测外源性IL-6对BBD9诱导的U266细胞生长抑制的影响,ELISA检测U266细胞培养上清IL-6水平,流式细胞术检测细胞膜上IL-6R的表达量,Real-time PCR检测细胞IL-6mRNA及IL-6R mRNA表达量,western blot检测细胞内各种激酶的磷酸化水平。结果:外源性IL-6减弱BBD9诱导的生长抑制。U266细胞在1μg/ml BBD9作用24h后,其生存率为88.83%,加用150ng/ml IL-6后,其生存率显著升高至104.83%;2μg/ml BBD9作用24h后,U266细胞的生存率仅有43.03%,而加用IL-6后,其生存率显著升高至55.93%。ELISA法检测U266细胞培养上清IL-6水平,发现BBD9能减少自分泌的IL-6。0、1、2、3μg/ml BBD9处理24h后,U266细胞培养上清中IL-6水平分别为33.49±7.92pg/ml、10.34±5.83pg/ml、13.59±7.22pg/ml、10.78±6.67pg/ml。此外,细胞膜上IL-6R的表达量也略有下降。1、2、3μg/ml BBD9处理8h,IL-6mRNA表达量分别是未处理组的0.9、3、2.7倍,而IL-6R mRNA无明显变化。BBD9处理后,U266细胞内IL-6信号传导途径中两个重要的激酶STAT3及AKT磷酸化水平均明显下调,而其总STAT3及总AKT均无改变。结论:(1)BBD9抑制骨髓瘤细胞自分泌IL-6及细胞膜IL-6R的合成,但并不在mRNA水平抑制二者的表达。(2)BBD9使骨髓瘤IL-6信号传导途径的STAT3和PI3K/AKT途径受抑。(3)IL-6信号传导途径受阻是BBD9诱导骨髓瘤细胞凋亡的一个重要机制。第四部分BBD9增加多药耐药K562/A02细胞对阿霉素的敏感性及其机制目的:研究BBD9能否逆转p-gp介导的急性白血病多药耐药及其机制。方法:MTT检测细胞对阿霉素的耐药性,流式细胞术检测细胞的凋亡率、测定细胞内阿霉素浓度及检测细胞膜表面p-gp表达量的变化,Real-time PCR检测细胞内mdr-1 mRNA表达。结果:阿霉素作用于K562/A02细胞24h的IC50为7.57μg/ml,作用于K562细胞24h的IC50为0.651μg/ml,K562/A02细胞耐药指数为11.65。2μg/ml阿霉素与1μg/mlBBD9单独或联合处理K562/A02细胞24h,结果发现:2μg/ml阿霉素处理组细胞凋亡率为6.04±2.28%,1μg/ml BBD9处理组细胞凋亡率为8.21±5.74%,对照组细胞凋亡率为6.59±2.56%。然而,2μg/ml阿霉素与1μg/ml BBD9联合处理组,细胞凋亡率明显升高至35.93±1.87%,与对照组相比差异具有显著统计学意义。但是,0.4μg/ml阿霉素与1μg/ml BBD9单独或联合处理K562细胞24h,结果显示:对照组凋亡率为1.77±0.58%,单用BBD9组凋亡率为3.52±2.0%,单用阿霉素组为11.77±8.44%,而BBD9联合阿霉素组的凋亡率为2.93±0.48%,各组之间差异无统计学意义。检测细胞内阿霉素浓度显示,BBD9处理1h,能使阿霉素阳性K562/A02细胞由单用阿霉素时的8.88±12.98%升高至87.82±12.03%;BBD9处理24h,能使K562/A02细胞阿霉素的平均荧光强度由单用阿霉素时的39.78±3.64%升高至54.4±5.63%。进一步的结果显示,BBD9并不能减少mdr-1 mRNA的表达,也不能影响细胞膜上p-gp蛋白的表达。结论:(1)BBD9能增加K562/A02细胞对阿霉素的敏感性,而不能增加K562细胞对阿霉素的敏感性。(2)BBD9通过提高p-gp高表达的K562/A02细胞内阿霉素浓度使得细胞对阿霉素的敏感性增加。(3)BBD9对化疗药物的增敏作用并不涉及p-gP蛋白数量的改变,可能是通过抑制p-gP的泵功能达到增敏作用的。总结:BBD9具有抑制多发性骨髓瘤细胞株及原代细胞生长的作用。这种生长抑制作用是与细胞凋亡有关的。在BBD9诱导的骨髓瘤细胞凋亡过程中,促凋亡蛋白Bim、Bax及Bak上调,而抑凋亡蛋白Mcl-1则下调。BBD9能通过下调cyclinA、cyclinB1使细胞周期阻滞于G2/M期。此外,BBD9还能增加骨髓瘤细胞核内FOXO3的表达量,抑制mir-17-5p,最终导致Bim蛋白表达增加。BBD9能抑制U266细胞IL-6和IL-6R合成,并抑制IL-6信号传导途径的两个重要途径:STAT3和PI3K/AKT途径。说明IL-6信号传导途径受阻是BBD9诱导的骨髓瘤细胞凋亡的一个重要机制。此外,我们的研究还发现BBD9能增加K562/A02细胞对阿霉素的敏感性,而不能增加K562细胞对阿霉素的敏感性。进一步研究表明,BBD9通过提高K562/A02细胞内阿霉素浓度实现逆转细胞对阿霉素的耐药。由于BBD9既不能降低mdr-1 mRNA表达量,也不能降低p-gP的蛋白表达量,提示BBD9可能是通过抑制p-gP的泵功能达到逆转耐药的作用的。