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研究背景和目的肺癌是一类严重危害人类身体健康和生命的常见恶性肿瘤,其发病率和死亡率居高不下。肺癌重要成员之一的非小细胞肺癌是我国常见恶性肿瘤,许多患者在诊断时就已经发生转移。近年来,在非小细胞肺癌(NSCLC)治疗方面虽然涌现出了许多低毒有效的新药物,但NSCLC患者的总生存时间仍无法得到明显延长,故探索控制NSCLC的新方法具有重要的临床意义。现代医学认为,肿瘤的发生与发展常常伴随着细胞生物学行为的异常改变。目前,在诸多肿瘤中可检测到异常表达甚至缺失的mi RNA,这提示mi RNA很可能具备促进肿瘤或者抑制肿瘤的功能,在肿瘤的进展中可能通过靶向调节原癌基因或抑癌基因来发挥一定的作用。其中,许多研究发现mi R-148b在人类多种类型的肿瘤中呈低表达,并发挥类似抗癌基因的作用,然而,mi R-148b对肿瘤进展的影响以及在非小细胞肺癌中潜在作用机制尚未得到充分探索。为了更好地了解mi R-148b在非小细胞肺癌中的生物学意义,在前期研究中我们初步测定了mi R-148b在PC14/B和A549人类非小细胞肺癌细胞系中的功能,通过实时荧光定量PCR检测肺癌患者与正常肺组织中mi R-148b的表达,进行MTT细胞增殖实验、平板克隆形成实验、Transwell细胞侵袭实验,发现mi R-148b对NSCLC细胞株增殖、克隆形成能力以及侵袭能力均有抑制作用。此次,我们研究了mi R-148b呈现过表达时对NSCLC细胞增殖和凋亡的影响,并进一步分析验证了其可能存在的作用机制。研究方法(1)重组慢病毒载体构建,病毒包装与滴度检测:将基因mi R-148b克隆至慢病毒r Lv-mi R-148b载体,作为mi R-148b过表达组,将干扰mi R-148b的表达的克隆至慢病毒r Lv-NC载体,作为阴性对照组r Lv-NC,分别共转染293T细胞,获得高滴度的慢病毒浓缩液;(2)分别稳定转染病毒r Lv-mi R-148b、病毒r Lv-NC和未重组慢病毒Lv-Blank于PC14/B和A549细胞系,获得稳转细胞株,实时荧光定量PCR测定各组细胞的mi R-148b表达量;(3)CCK-8法、平板克隆形成实验、PI单染法细胞周期检测、Annexin V-FITC/PI双染色法细胞凋亡检测和免疫印迹实验测定改变mi R148b的表达对NSCLC细胞增殖和凋亡的影响及其可能的作用机制。研究结果(1)实时荧光定量PCR测定稳转后PC14/B和A549细胞系中mi R-148b的表达量,空白对照组为:PC14/B-Blank、A549-Blank,阴性对照组为:PC14/B-NC、A549-NC,mi R-148b过表达组为:PC14/B-mi R-148b、A549-mi R-148b;(2)稳转后PC14/B和A549细胞的CCK-8细胞增殖实验和平板克隆形成测定显示:与空白对照组相比,mi R-148b的过表达显著抑制PC14/B和A549细胞的增殖和集落形成,并且沉默mi R-148b的表达可逆转PC14/B和A549细胞中mi R-148b抑制细胞增殖和集落形成的作用;(3)PC14/B和A549的细胞转染后细胞周期分布显示:与空白对照组相比,mi R-148b过表达组,G2/M期细胞数明显减少,而沉默mi R-148b表达组,G2/M期细胞显著增加;(4)Annexin V-FITC/PI双染色后,通过流式细胞仪分析并量化转染后PC14/B和A549细胞的凋亡率,根据各组的早期凋亡率发现mi R-148b过表达细胞的凋亡率高于空白对照组,而沉默mi R-148b表达的细胞凋亡率低于空白对照组;(5)免疫印记实验分析显示,与空白对照组比mi R-148b的过表达明显降低PC14/B和A549细胞中磷酸化JNK蛋白的表达,而JNK上游的刺激信号MKK4蛋白、MKK蛋白7和总的JNK蛋白的表达不受影响,并且沉默mi R-148b的表达能够重新激活JNK的磷酸化。研究结论(1)mi R-148b的过表达抑制NSCLC细胞增殖;(2)mi R-148b的过表达减少NSCLC中G2/M期的细胞,阻滞NSCLC进入有丝分裂期;(3)mi R-148b的过表达诱导NSCLC细胞凋亡;(4)mi R-148b通过降低NSCLC细胞中磷酸化JNK的表达来抑制MAPK/JNK信号通路发挥抑制细胞增殖与诱导凋亡的作用。