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癫痫是一种常见的中枢神经系统疾病,诱发因素繁多,发病机制至今尚未完全阐明,但各种癫痫发作的本质都是由中枢神经系统兴奋—抑制系统失衡,从而导致某些神经元群发生突然、过度和同步化异常放电所引起的行为异常。GABA及其受体系统作为成年中枢神经系统的主要抑制体系,在癫痫的发病机制中扮演了重要的角色。过去的研究表明GABA递质水平和受体数目类型的改变参与了癫痫的发病机理,除此之外,最近的研究同时也预示着细胞内氯离子稳态可能也参与了癫痫的发病机制,而氯离子内稳态的调节与氯离子共转体KCC2密切相关。本研究利用CTZ癫痫模型,在离体和整体水平首次系统的研究了KCC2与癫痫发病机制的关系及其可能的保护机制。本论文研究的第一部分着重阐明KCC2在癫痫发病进程中的作用及其机制。实验结果表明无论在培养细胞、海马脑片还是整体动物上,致痫药物CTZ都可以诱发癫痫样的活动,并导致神经元膜上KCC2表达的下调；在离体脑片上进一步发现CTZ作用后,会引起神经元对氯离子泵出功能的减弱以及引起神经元氯离子平衡电位(EGABA)向去极化方向偏移；利用KCC2抑制剂furosemide阻断KCC2活性可以异化CTZ诱发的癫痫活动的出现；而通过分子生物学手段在培养海马神经元过表达KCC2能够显著抑制CTZ诱发癫痫样发电的细胞比例。由此,第一步分结果提示了KCC2功能性下调是CTZ诱发癫痫的基本机制之一。本论文研究的第二部分针对KCC2作为靶点,研究了KCC2抑制剂在癫痫中对神经元膜上KCC2蛋白的保护作用,以期阐明通过对KCC2蛋白的调控保护,并将其作为抗癫痫研究的新领域。分子生物学、形态学和电生理学研究结果发现furosemide作为KCC2阻断剂,在急性癫痫状态下可以稳定神经元细胞膜上的KCC2蛋白使之不下膜,furosemide也阻断了CTZ引起的神经元EGABA向去极化方向偏移,并进一步发现furosemide对KCC2蛋白及功能的保护作用不是建立在其抗癫痫作用基础之上。我们进一步的研究发现CTZ急性处理海马脑片诱导KCC2下膜的同时还会导致GABA电流的减小、GABA受体β2/β3亚单位的减少,而当furosemide与CTZ共同作用时,furosemide还具有保护GABAA受体和GABA电流的作用。进一步对其机制的研究发现,膜上KCC2蛋白可能对GABA受体的分布具有调控作用。实验发现应用分子生物学手段在培养海马神经元中特异性地下调KCC2蛋白的表达后,神经元总GABA电流密度不变而mIPSCs幅度减小以及突触外受体介导的tonic IPSCs密度增加,且这种增加不是由包含δ亚基的突触外GABAA受体增加导致的,提示了可能会是包含α5亚基的突触外GABAA受体的增加介导的。由此,电生理结果结合形态学结果提示了furosemide在保护KCC2膜上蛋白的同时还具有稳定抑制性突触内外的GABAA受体的分布及其功能的作用。本论文结果阐明了神经元膜上KCC2蛋白的下调是癫痫诱发及其进展的重要机制之一；而KCC2蛋白下调会影响GABAA受体在抑制性突触的空间分布,这种作用可能是癫痫或者其他疾病之后GABAA受体变化及其GABA抑制效率降低的基本机制；KCC2抑制剂furosemide在癫痫急性发作期具有稳定神经元膜上KCC2蛋白的作用,从而通过开发应用furosemide或相应的KCC2蛋白抑制剂对抑制癫痫的发生发展具有重要意义。