禽流感病毒(Avian influenza vlrus，AIV)是禽类中分离出来的A型流行性感冒病毒各种亚型的总称，禽流感是一种由禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)引起的急性传染病。目前，在世界各地分离的16个H亚型和9个N亚型禽流感病毒中，高致病性禽流感均由高致病性禽流感病毒(Highlu pathogenic Avian Influenza Virus，HPAIV) H5或H7亚型病毒引起。1997年香港H5N1禽流感传人事件的发生，改变了人们传统上认为禽流感不能直接传人的概念。截止2009年4月21日，全世界已先后有420例人感染H5N1，导致257人死亡。迄今我国已有38例人感染病例，导致25例死亡。AIV的致病性取决于病毒与宿主之间的相互作用，Ⅰ型干扰素在宿主抗病毒感染中发挥着极其重要的作用，它先于机体的免疫应答反应，是机体第一道病毒防御体系，也是影响流感病毒感染细胞的关键因素，MxA基因属于干扰素刺激基因(Interferon—stimulated genes，ISGs)，在防御流感病毒机制中起到重要作用。同时，流感病毒的非结构蛋白1(Non—structural protein1，NS1)能拮抗干扰素的产生，逃避干扰素的抗病毒作用。目前，AIV致病机制还不清楚，可能是多基因共同作用的结果，研究机体对病毒的免疫反应及AIV的NS1蛋白，有望进一步揭示NS1蛋白的功能及其调节AIV致病力的机制。因此，我们设计本课题，旨在建立一人呼吸道上皮细胞模型，更好的观察禽流感病毒H5N1不同毒株对细胞的致病力，并在细胞水平研究对禽流感病毒诱导产生的机体固有免疫反应情况，从NS1基因方面寻找影响禽流感病毒致病力差异的原因，从而为研究NS1蛋白参与AIV致病的机制奠定基础。 材料和方法： 1.H5N1亚型AIV病毒在A549细胞中的复制效应研究： 毒株：H5N1亚型AIV75及AIV128株由华南农业大学禽病研究室惠赠，分离、鉴定和保存。 细胞：鸡成纤维细胞(Diploid chicken fibroblasts cell，DF-1)，人肺泡癌上皮细胞(Human lung adenocarcinoma cell，A549)。 实验内容：将两组病毒悬液用细胞维持液稀释，用MOI=2的感染裁量，接种A549细胞，分别在感染接种后0h、8h、16h、24h、48h收集细胞及细胞上清液。细胞上清液接种DF-1细胞，按Reed—Munch法计算两毒株的组织培养半数感染量TCID50(Tissue culture infectious dose50)。并从细胞上清液中提取病毒RNA，逆转录，经PCR扩增病毒的HA、M1片段。判断比较两毒株在细胞中的增殖情况。 2.H5N1亚型AIV病毒在细胞中诱导IFNα/β、MxA mRNA转录水平比较： 实验内容：分别收集AIV75、128感染0h、8h、16h、24h、48h的A549细胞，及收集不同浓度IFN—α2a作用后的A549细胞，提取细胞总RNA，逆转录合成cDNA，用荧光定量PCR扩增IFN—α、IFN—β、MxA基因片段，计算相对表达量。 统计学分析：数据结果用SPSS11.5软件对不同时间段、不同毒株间及不同浓度IFN—α2a作用下，IFN—α、IFN—β、MxA基因的表达水平进行统计描述和分析。 3.H5N1亚型AIV非结构蛋白NS1编码基因推导氨基酸序列的比较分析： 实验内容：AIV75、AIV128通过鸡胚增殖后提取RNA、逆转录合成cDNA，经PCR扩增和产物纯化，由双脱氧链终止法进行核苷酸序列测定并进行基因特性分析。应用DNASTAR(Version4.0)分析软件包中的Editseq软件进行核苷酸序列的分析和氨基酸序列的推导，MegAlign软件对基因进行序列同源性比较。 结果： 1、感染A549细胞后不同时间段，AIV75，AIV128两毒株的复制情况。AIV75、AIV128均能感染A549细胞，但在A549细胞中均不引起细胞病变。AIV128随着感染时间的增加，病毒复制增加。而AIV75复制效率低下。AIV128在A549细胞中的增殖情况要好于AIV75。 2、病毒感染A549细胞后IFN—α、IFN—β mRNA转录水平 结果显示，在AIV75、AIV128感染的A549细胞，感染后8小时能检测到IFN—α/βmRNA，表达量随感染时间延长而增加，在24小时时达到高峰。每个检测时间段，AIV128诱导细胞产生的IFN—βmRNA表达量均较AIV75高。 3、病毒感染A549细胞后MxA mRNA转录水平 结果显示，在AIV75、AIV128感染的A549细胞，感染后8小时能检测到MxA mRNA表达，表达量随感染时间延长而增加，每个时间段的MxA mRNA表达量比IFN—α/β mRNA表达量高。在感染后24小时IFN—α/β mRNA表达达到高峰时，MxA mRNA表达量仍有增加，而在无病毒感染的细胞中没有检测到MxA mRNA表达。每个检测时间段，AIV128诱导细胞产生的MxA mRNA表达量均较AIV75高。 4、不同浓度IFN—α2a诱导下A549细胞MxA mRNA相对表达量 结果显示，在没有IFN—α2a处理的情况下，细胞不表达MxA mRNA，MxA基因表达水平随着IFN—α2a作用浓度的增加而增加。 5、两株H5N1亚型AIV非结构蛋白NS1编码基因推导氨基酸序列的比较分析 扩增出AIV75、AIV128两毒株的NS片段全基因cDNA，NS1基因有1个ORF，编码225个氨基酸序列组成的NS1蛋白，两毒株相比，NS1蛋白C端3个位点的氨基酸序列出现变化166位D(75株)→G(128株)，190位S(75株)→T(128株)、224位K(75株)→E(128株)。 结论： 1、H5N1亚型AIV75、AIV128毒株能在人肺泡癌上皮细胞A549中复制，其中不同的毒株随着感染时间的延长，病毒复制效率有所不同。 2、细胞IFN—α/β、MxA mRNA的转录诱导是依赖于病毒复制的。不同的毒株诱导IFNα/β、MxA产生的作用是有差异的。MxA mRNA与IFN—α/βmRNA转录水平相平行，而MxA mRNA半衰期更长。 3、AIV75、AIV128两毒株的NS1片段全基因cDNA有1个ORF，编码225个氨基酸序列组成的NS1蛋白。不同毒株NS1氨基酸序列有差异，可能与其拮抗干扰素的能力不同有关。