研究背景：在女性恶性肿瘤中乳腺癌的发病率占第一位,其发病率及死亡率在西方国家中均居女性恶性肿瘤的首位。近十年来,我国乳腺癌的发病率在有逐年上升和年轻化的趋势,严重危害妇女健康。在过去几十年,乳腺癌治疗效果已经取得了巨大的进步。例如,手术前新辅助化疗,结合放疗、内分泌治疗及免疫治疗等降低了复发几率,提高了生存率和生活质量。然而,癌症的疗效仍不理想,特别是对于晚期乳腺癌患者。因此,开发早期发现乳腺肿瘤的方法有极高的应用价值。在早期发现乳腺肿瘤方面,我们应该把焦点放在发现癌前病变上。探测到癌前病变并施行微创手术时一项有效的治疗肿瘤策略。在体检中心应用超声、钼靶等常规检查方法可以发现乳腺包块,病理检查可以区分良性病变与癌前病变。然而,这样的检查不能提示乳腺肿瘤的增值率,因此必须结合肿瘤扩增指标综合判断。近年来大家关注乳腺癌方面的研究课题主要集中在乳腺癌的预后因素上,目前研究的关注点多认为乳腺癌的预后与临床病理分期、淋巴结转移、组织学类型、激素受体、肿瘤增殖分数以及p53,C-erb-2等致癌基因有关。目前越来越多有关乳腺癌预后的标志物也被提出,如表皮生长因子受体、nm23基因、E-钙黏蛋白等。我们感兴趣的是在血清中检测这类异常蛋白升降水平,这样可以不用通过侵入性方法取样,来帮助我们评估肿瘤早期发生、肿瘤全切除后的效果以及疾病复发和预后评估。基于肿瘤细胞增殖标志物的理论基础是由于肿瘤细胞失去正常细胞生长调控导致细胞恶性增殖,这一理论引导研究开发一种准确、无侵害性的血清学检验方法,即在现有仪器可能检测出肿瘤以前,将可能更早期检测已有肿瘤疾病或潜在的恶变,将给患者提供更好的治疗时机。因此,寻求一种既与肿瘤细胞增殖生长密切相关的,又可用于血清学和组织学的肿瘤细胞增殖标志物标记物是我们一直追求的目标。70年代初,称为“胚胎肿瘤抗原”CEA的发现,一度使人们相信,一种肿瘤特异性抗原被发现了。现一系列单克隆抗体,如CEA, CA19-9,CA125, CA15-3,由于它们的特异性未达到我们的期望,已在临床上应用仍有争议(12,13)但是通过对CEA及其它胚胎肿瘤抗原的研究为我们提供了许多有价值有关血液循环类肿瘤标记物不同特性的信息。Her2是一新临床应用的乳腺肿瘤蛋白质标记物,适用于血清学和组织学的检测已及免疫治疗,但Her2基因显性在乳腺癌中仅仅为25-30%(14),也限制了应用范围。胸苷激酶(TK)是DNA补救合成途径的限速酶,在评估增殖细胞的增殖度中的起重要作用。人类细胞中有两种TK同工酶,一种位于细胞质中称为TK1,另一种位于线粒体中称为TK2,TK1是S期特殊酶,其浓度与DNA合成呈正相关,并随细胞周的变化而变化。既往研究表明,非增殖细胞的TKl和健康人血清和组织中的TK1,其含量极微或检测不到,但在恶性肿瘤患者中,TK1酶伴随着肿瘤细胞数的急剧增殖而升高。目前国内外有很多报道是针对TK1在肺癌、宫颈癌、肠癌等肿瘤中的表达及其与肿瘤危险程度的关系,均认为TKl的表达与肿瘤恶性程度正相关并影响肿瘤患者的预后。目前很多研究除了关注TKl在肿瘤组织中表达情况外,更多研究对血清TK1浓度及其动态变化感兴趣,并且探索TK1在辅助诊断、疗效监测、肿瘤筛查及预后判断中的作用。第一部分胸苷激酶TK1在乳腺癌中表达的临床意义目的：研究乳腺癌患者、乳腺良性病变患者、健康人群组织中TK1表达及外周血中TK1浓度是否存在差异及其临床意义。方法和步骤：研究对象：(1)选取乳腺导管增生(UDH)、不典型增生(ADH)、导管原位癌(DCIS)与浸润性导管癌(IDC)患者研究TKl表达,UDH患者(n=25),ADH患者(n=22)。正常乳腺组织(n=20)取自UDH患者但与UDH组织分开作为对照。IDC(n=60)患者与DCIS(n=25),所有患者标本2010-2012年均取自深圳市第二人民医院病理科。肿瘤标本病理分期根掘AJCC癌症分级标准,分级依据WHO肿瘤分期标准。IDC：分级1级n=12,2级n=34,3级n=14；分期：Ⅰ期n=23，Ⅱa期n=19,Ⅱb期n=19,Ⅲa期n=2; DCIS分级：1级n=12,2级n=11,3级n=2；分期：所有患者均为0期。所有的癌前病变ADH诊断均依据WHO推荐标准。(2)上述IDC患者标本,首先对标本进行常规病理分析,分析其组织学特征,病理及临床分期包括病理分化程度及淋巴结转移情况。在常规检查之后再应用免疫组化法检测乳腺癌组织中相关标志物表达情况,如ER、PR、p53C-erbB-2、Ki-67及TK1。(3)本实验共收集90例外周血样本,其中乳腺癌患者60例、乳腺良性病变患者20例、健康人10例,应用增强发光-免疫点印染法检测血清中TK1浓度。参与实验的患者都签署了知情同意书。免疫组化MaxVisonTM法检测乳腺癌组织中TK1的表达：将组织标本石蜡包埋后进行连续切片,每片厚度4微米,切好后展开放置于经粘片剂APES处理过的载玻片上,置58～60℃烤箱中,烘烤60～120min。用二甲苯将切片脱蜡,用酒精梯度水化切片,用PH=7.4的PBS冲洗切片3次,每次3分钟。应用微波修复抗原：将切片浸入塑料染色缸中,染色缸装有PH=6.0的柠檬酸缓冲液,应用微波炉加热柠檬酸缓冲液至沸腾后停止加热,每次加热间隔5-10分钟,共加热15～20分钟。将切片放于室温下自然冷却,用PBS洗涤3次,每次3分钟。在每张切片加一滴或50u1的3%的H2O2,室温下孵育10分钟,此举目的是灭活内源性过氧化物酶。用PBS冲洗切片3次,每次3分钟。在切片上滴加一滴一抗TK1,在室温下孵育60分钟。用PBS冲洗3次,每次3分钟。再在切片上滴加二抗,二抗为快捷型酶标羊抗鼠/兔IgG聚合物,在室温孵育30分钟。用PBS冲洗3次,每次3分钟。DAB显色：在切片上加显色试剂盒中A、B、C试剂各1滴,每滴中加0.85m1蒸馏水,充分混匀,放置于室温下避光显色3-5min,蒸馏水洗去试剂。用苏木素轻度复染切片,用自来水漂洗15mmin,用酒精梯度脱水,二甲苯透明,最后中性树胶封片。处理好的切片在光学显微镜观察结构。血清酶免疫点印迹化学发光法检测：分别将校准品1、校准品2、校准品3点样到硝酸纤维素膜的A1、A2及A3位置上,每孔3μ1；待检患者血清按顺序每孔3μ1点在后面的空孔上,将点好样品的硝酸纤维素膜放在室温下自然凉干,大约30mmin。用蒸馏水配制pH为7.6的抗体稀释液,洗涤液和封闭剂。在反应盒内首先用配置后的稀释液洗膜2次,清洗时需要轻轻振荡摇晃纤维素膜,每次大约1mmin。清洗过后加入封闭剂,封闭大约30min。将膜放入按1：500稀释度的TK1-IgY抗体中在室温下振荡摇晃让抗体与样本充分反应,大约120min；反应结束后用洗涤液洗涤纤维素膜3次,每次5mmin。将膜放入按1：500稀释度的生物素化抗IgY二抗中,在室温下振荡摇晃让抗体与样本充分反应,大约40min；反应结束后用洗涤液洗涤纤维素膜3次,每次5min。将膜放入按1：1500稀释度的SA-HRP中,在室温下振荡摇晃让抗体与样本充分反应,大约60min;反应结束后用洗涤液洗涤纤维素膜3次,每次5min。将膜浸入ECL发光试剂中,反应1min；将膜片取出,用吸水纸吸干发光试剂,同时将膜放入压膜透明胶片内挤干剩余溶液中,重新开始计时5min。将处理好的膜放入化学发光成像分析仪,待5min计时结束后进行分析及拍摄。结果(1)正常的乳腺组织TK1染色为阴性或弱阳性。在UDH中,只有少数细胞染色,染色部位位于细胞浆。从DCIS至IDC患者,TK1染色逐渐加深。大部分TK1染色位于细胞浆中,只有小部分TK1染色位于细胞核内。(2)在乳腺癌患者中,TK1的阳性表达率为85%(51/60),TK1表达与年龄、腋窝淋巴结转移等因素相关不明显,差异无显著性,而与组织学分级、肿块大小TNM分期成明显相关,差异有显著性(P均<0.05)。(3)TK1是在细胞水平表达,因此,肿瘤细胞中染色的数目可以使我们准确的了解不同肿瘤组织中TK1的表达情况。正常乳腺组织中TK1不表达或表达低于5%,UDH中TK1表达明显升高为3.3±1.4%,ADH中TK1的表达为8.6±2.8%,两者有明显统计学差异(P<0.001)。DCIS中TK1的表达明显升高20±14%,IDC中更是高达29.1±21.4%。在本组实验对象中,80-90%的ADH、DCIS及IDC患者TK1表达高于5%,而UDH患者中,只有10%患者TK1表达高于5%。(4)在DCIS与IDC患者中,TK1的表达从Ⅰ级到Ⅲ级逐渐升高。在IDC患者中,尽管不同分期之间TKl的表达有重叠,大体上也与肿瘤的分期成正相关。TK1表达的均值Ⅰ期与Ⅱa期(P=0.029),Ⅰ期与Ⅱb期及Ⅲa期(P<0.001),Ⅱa与Ⅱb期(P=0.196)。肿瘤直径>3cm的患者TK1表达明显升高(P<0.001)。(5) ADH、DCIS与IDC患者的平均年龄分别为40.6±8.1,45.3±5.6,50.3±13岁,UDH患者的平均年龄为43.5±7.7岁。(6)外周血中血清TK1浓度在乳腺癌患者、乳腺良性病变患者及正常人中表达不同,差异有显著性,不同级别乳腺癌患者外周血中血清TK1浓度表达也不同,差异有显著性,即乳腺病变恶性程度越高,患者外周血中血清TK1浓度也相应升高。结论(1)在不同组织学分级及TNM分期的乳腺癌中,TK1的表达存在差异,组织学分级及TNM分期升高,TK1的表达也相应升高,TK1是反应乳腺癌细胞增殖的一个敏感的标准。(2)在乳腺癌的预后因素中,高浓度的TK1与高分级的组织病理学表现可以作为预测乳腺癌复发转移的危险因素。(3)在正常人、乳腺良性病变、由低至高的组织学分级的乳腺癌中,血清TK1浓度逐渐升高,由此得出结论通过检查外周血血清TK1可以作为诊断乳腺癌病变的一个指标。第二部分血清中胸苷激酶TKl在乳腺癌新辅助化疗中的临床意义及功能目的：(1)探讨局部晚期乳腺癌患者新辅助化疗前后外周血TKl含量的变化。(2)探讨外周血TK1含量的变化对乳腺癌患者预后的意义。方法和步骤：研究对象：选取2010年10月-2012年3月深圳市第二人民医院乳腺外科就诊的48例局部晚期乳腺癌患者,其中不包括炎性乳腺癌患者。所有的患者都进行标准的新辅助化疗,大部分患者接受了4个疗程的环磷酰胺+表柔吡星序贯4个疗程的多西他赛。手术方式包括乳腺癌改良根治术或保乳手术。术后按照乳腺癌治疗指南行辅助腋窝放疗、内分泌治疗或分子靶向治疗。随访包括术后第一年每三个月进行一次询问病史及体检,第二年每六个月进行一次,以后每年体检一次。检查项目包括胸部X片、钼靶、血常规及肝功能等常规检查,其它附加的检查要依据患者的病史或检查结果。所有的数据整理记录,包括确诊时年龄、肿瘤分期、治疗方案、随访配合、研究终止点。研究终止点设定为肿瘤复发或与肿瘤相关的死亡。按以下时间点采集血清标本：新辅助化疗前,每次新辅助化疗后,手术后,每次辅助化疗后,辅助化疗后第3、6、12、24个月。因为统计学原因,48名患者采取新辅助化疗前、手术前、手术后辅助化疗前及辅助化疗后3个月4个时间点进行数据统计。血清酶免疫点印迹化学发光法检测：用蒸馏水配制pH为7.6的抗体稀释液,洗涤液和封闭剂。将校准品1、校准品2、校准品3点样到硝酸纤维素膜的A1、A2及A3位置上,每孔3μ1；待检患者血清按顺序每孔3μ1点在后面的空孔上,室温下自然凉干,30min。在反应盒内用配置后的稀释液振摇洗膜2次,每次1min。加入封闭剂,封闭30min。按1：500稀释度加入TK1-IgY抗体,室温下振摇反应120mmin；弃去反应液后用洗涤液振摇洗涤3次,每次5min。按1：500稀释度加入生物素化抗IgY二抗,室温下振摇反应40min；弃去反应液后用洗涤液振摇洗涤3次,每次5min。按1：1500稀释度加入SA-HRP,室温下振摇反应60mmin；弃去反应液后用洗涤液振摇洗涤3次,每次5min。加ECL发光试剂,过膜浸湿,精确反应1min后将膜片用吸水纸吸干,重新计时5min,同时将膜放入压膜透明胶片内挤干剩余溶液。将膜放入化学发光成像分析仪内,待5min计时结束后进行拍摄及分析。HER-2的检测应用FISH方法检测HER-2≥2定义为阳性。雌激素与孕激素受体水平检测雌激素与孕激素受体水平检测应用免疫组化法。活性>10%定义为阳性。统计分析统计分析应用SPSS软件。S-TK1,肿瘤大小,肿瘤分级,HER-2,淋巴结状态,ER与PR等应用t检验,卡方分析,Spearman相关分析。生存分析应用Kaplan-Meier法,P≤0.05有统计学意义。结果：(1)本实验共有48名患者参与,确诊的平均年龄为49岁,平均随访的时间为28个月。由于是局部晚期乳腺癌,大部分(46名)患者接受了改良根治术。共有22名患者出现了肿瘤的复发,其中18名(81.8%)患者出现远处转移。由于我们所检测的乳腺癌标本S-TK1浓度有波动,根据既往的研究结果,我们将S-TK1浓度2.0定为临界值。患者分为2组：S-TK1低表达组(<2.0PM,n=19)及S-TK1高表达组(>2.0PM,n=29)。(2)通过本研究注意到,血清中S-TK1高的患者较血清中S-TK1低的患者有更高的复发风险及癌症相关的死亡。尽管高S-TK1浓度似乎可以作为预后指标,但我们必须评价S-TK1是否是淋巴结状态的协变量,换句话,即高S-TK1水平是否可以替代阳性淋巴结作为预后指标?这两个变量之间没有明显的统计学联系(P=0.11),因此可以明确高S-TK1浓度并非淋巴结状态的协变量。下一步,本实验继续评价高S-TK1浓度是否与其它已知的临床及病理指标相关。经过统计学分析,我们发现高S-TK1浓度与肿瘤大小(P=0.15)、淋巴结状态(P=0.11)、ER (P=0.63)、PR (P=0.45)、及HER-2(P=0.89)均没有明显相关,由此提示S-TK1浓度是一个独立的预后指标。(3)为了进一步验证局部晚期乳腺癌新辅助化疗后血清中S-TK1浓度可以作为独立的预后指标,我们用COX回归分析来比较S-TK1及其它已知的临床病理指标所预示的肿瘤复发风险(表2)及肿瘤相关死亡风险(表3)。无论对于DFS还是肿瘤相关死亡,S-TK1过表达及转移淋巴结状态都是预后指标。新辅助化疗后,血清中S-TK1高浓度患者较低浓度患者肿瘤复发的风险明显增高(P=0.003)。作为对照,淋巴结转移到患者较未转移患者的肿瘤复发风险明显增高(P=0.002)。结论：(1)血清中S-TK1高的患者较血清中S-TK1低的患者有更高的复发风险及癌症相关的死亡。(2)S-TK1浓度可以作为局部晚期乳腺癌的一个相关预后指标。创新性及意义1.本课题首次检测了乳腺癌外周血TK1的表达情况,通过临床资料分析、病例随访,阐述了外周血TK1的表达与病人转移和预后的相关性。2.本课题首次研究了TK1在乳腺癌组织与病人外周血中的表达情况,深入探讨了TK1在乳腺癌的发生、发展及预后中的作用。3.本课题首次将TKl与淋巴结转移情况进行了对比,阐明了TK1可以作为乳腺癌预后的相关指标。