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目的：①构建pET21a(+)/ZHPV16E7384-ZHPV18E7228、pET21a(+)/ZHPV16E7384-2、pET21a(+)/ZHPV18E7228-2三个双特异重组质粒并鉴定，通过原核表达系统进行表达纯化ZHPV16E7384-ZHPV18E7228 affibody（Z384-Z228）、ZHPV16E7384-2 affibody（Z384-2）、ZHPV18E7228-2affibody（Z228-2)重组蛋白并进行验证。②Z384-Z228、Z384-2、Z228-2分子进行体外亲和力及特异结合力的检测；③Z384-Z228、Z384-2、Z228-2分子在裸鼠荷瘤模型中的体内靶向结合作用检测。 方法：⑴本实验室前期验证的ZHPV16E7384affibody（Z384）和ZHPV18 E7228affibody（Z228）经密码子优化后的核苷酸序列，以柔性肽G4S3连接，委托生物公司全基因合成并测序验证；⑵将全基因合成成功并测序正确的Z384-Z228、Z384-2、Z228-2重组质粒转化至表达载体-大肠杆菌BL21（DE3）中，并通过IPTG（异丙基硫代-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)诱导表达出Z384-Z228、Z384-2、Z228-2重组蛋白，随后进行Ni-NTA树脂亲和层析的方法纯化三个重组蛋白，同时诱导表达出相应的affibody单体蛋白(Z384, Z228)及对照野生型Zwt蛋白，最后经过SDS-PAGE电泳、DOT BLOT(斑点试验)及WesternBlotting分析鉴定。⑶与靶蛋白结合亲和力分析：应用SPR(表面等离子共振技术)，分别检测Z384-Z228、Z384-2、Z228-2与对应靶蛋白HPV16E7和HPV18E7结合的亲和力，并以Zwt作为对照蛋白。⑷与细胞表达靶蛋白结合特异性分析：选择宫颈癌Siha细胞株（HPV16E7表达阳性）、宫颈癌HeLa229细胞株（HPV18E7阳性）及人黑色素瘤A375细胞株（HPV阴性）为研究对象。用间接免疫荧光的方法检测上述三个双特异性重组蛋白分子与Siha细胞表达的HPV16E7蛋白、HeLa229细胞表达的HPV18E7蛋白的特异性结合能力，并以相应的单体及Zwt作为对照蛋白。⑸对细胞半数有效抑制率的检测：将Siha，Hela229细胞株分别孵育Z384-Z228、Z384-2、Z228-2重组蛋白，采用CCK8试剂盒检测其对相应细胞生长的抑制作用，并计算其相应的半数有效抑制率IC50值。⑹对细胞生长抑制的作用的检测：将Siha，Hela229，细胞株分别孵育Z384-Z228、Z384-2、Z228-2重组蛋白和对照蛋白Zwt,采用CCK8试剂盒检测其对相应细胞生长的抑制作用。⑺体外靶向免疫组化水平验证：将Siha，Hela229，A375细胞荷瘤裸鼠组中的肿瘤进行石蜡包埋病理切片，分别采用Z384-Z228、Z384-2、Z228-2三种重组蛋白及HIS抗体作为一抗检测；同时将Zwt重组蛋白和PBS血清抗体分别作为对照，以检测三个重组蛋白分别与相应肿瘤组织所表达的靶抗原HPV16E7、HPV18E7的特异性结合与识别能力。⑻建立宫颈癌荷瘤裸鼠模型：选择3-4周龄BALB/c雌性裸鼠将其饲养在SPF级实验环境中，观察饲养一周后，将培养状态良好的Siha,HeLa229细胞株悬液经皮下接种在裸鼠腋窝靠近背部的左右两侧肩胛位置，左侧接种Siha细胞，右侧接种Hela229细胞，同时建立A375细胞荷瘤裸鼠模型组用以对照比较。待裸鼠成瘤后分别取瘤体提取组织DNA进行PCR鉴定和病理切片观察。⑼HPV16/18 E7双特异affibody重组蛋白的近红外荧光染料标记：调整affibody重组蛋白浓度至一致，避光条件下，按1:20的比例加入Dylight755荧光染料，用移液枪混匀插于冰盒中，放于4℃冰箱偶联过夜，经15％的SDS-PAGE电泳鉴定，放于小动物活体成像仪中拍片。⑽HPV16/18 E7双特异affibody重组蛋白靶向肿瘤的近红外成像定位分析：待宫颈癌细胞和A375黑色素瘤细胞（作为肿瘤对照组）荷瘤裸鼠肿瘤长至500mm3左右，将Dylight755标记成功的Z384-Z228、Z384-2、Z228-2各200ul通过尾静脉分别注射至小鼠体内，并通过小动物活体近红外成像系统分别采集0min、30min、1h、2h、4h、6h、8h、12h、24h、48h、72h及96h的图像，分析不同时间点荧光的分布及代谢情况。同时以Zwt作为对照蛋白。 结果：①HPV16/18 E7双特异affibody重组质粒的构建、原核表达及纯化：经全基因合成的Z384-Z228、Z384-2、Z228-2三个重组质粒通过测序证实构建成功；随后转化至大肠杆菌原核表达系统进行诱导表达，采用Ni-柱树脂亲和层析的方法纯化获得了Z384-Z228、Z384-2、Z228-2三个重组蛋白，并经SDS-PAGE鉴定在分子量约15kDa左右的位置处出现了单一条带，与理论大小相符；进一步经Dot blot Western Blot分析验证正确。②SPR(表面等离子共振技术)检测结果显示Z384-Z228双特异与靶蛋白HPV16、18E7均具有高亲和力，Z384-2和Z228-2双特异分别与相应的靶蛋白HPV16E7和HPV18E7具有高亲和力，对照蛋白Zwt则对HPV16、18E7蛋白几乎没有亲和力。③细胞间接免疫荧光结果显示，在孵育了相应蛋白的细胞的细胞核及核周胞浆均出现了紫色点状或团块状的荧光，证实了Z384-Z228能同时与宫颈癌细胞表达的HPV16E7、HPV18E7蛋白具有特异性结合力，而Z384-2仅与宫颈癌细胞表达的HPV16E7蛋白， Z228-2仅与宫颈癌细胞表达的HPV18E7蛋白有特异性结合力。④细胞增值实验结果验证了Z384-Z228对Siha和HeLa229细胞均具有生长抑制作用，Z384-2和Z228-2对相应的Siha和HeLa229细胞具有生长抑制作用。其对靶细胞的半数有效抑制率用IC50表示，Z384-Z228对Siha和HeLa229的IC50分别是1.618umol和3.127umol，Z384-2和Z228-2双特异对Siha和HeLa229的IC50分别是2.431umol和10.38umol。⑤运用免疫组织化学技术验证了三个重组蛋白affibody分子与相应肿瘤细胞所表达的HPV蛋白的特异性靶向结合力和识别力。在分别孵育了Z384-Z228的宫颈癌组织切片Siha、HeLa229细胞组的细胞核及细胞浆出现了与孵育阳性对照16E7兔多克隆血清抗体(Siha)、18E7兔多克隆血清抗体(HeLa229)一样的深棕色沉淀，孵育了Z384-2的宫颈癌组织切片Siha细胞的细胞核及细胞浆出现了深棕色沉淀，而对照细胞HeLa229、A375细胞组均未见；同样在孵育了Z228-2的Hela229细胞组，也出现了类似的棕色沉淀，而Siha、A375细胞组均未见。⑥成功建立了荷瘤裸鼠肿瘤模型，并分别采用HPV16/18E7特异性引物，通过PCR技术对三组荷瘤裸鼠肿瘤中的HPV16/18E7基因进行检测，结果显示，Siha细胞肿瘤组织中HPV16 E7DNA为阳性，HPV18E7 DNA为阴性；HeLa229细胞肿瘤组织HPV18E7DNA为阳性，HPV16 E7DNA为阴性；而A375细胞肿瘤组织HPV16和18 E7DNA均为阴性。⑦DYlight755标记结果：经SDS-PAGE电泳避光鉴定，置凝胶于小动物近红外成像仪检测，通过小动物近红外成像仪观察，出现和相应考染蛋白条带大小一致的红色荧光条带，证实标记成功⑧将标记成功的affibody重组蛋白，通过尾静脉注射至小鼠体内，经活体小动物成像仪观察不同时间点荧光分布及代谢情况，可知，在正常裸鼠体内近红外标记的蛋白均出现5min呈全身性分布，随着时间的延长，逐渐向肾脏聚集，8小时左右肾脏荧光信号表现为最强，最后逐渐消退，证实荧光标记的蛋白主要通过肾脏代谢。⑨DYlight755标记的双特异affibody在荷瘤裸鼠体内靶向肿瘤成像的检测：Siha和HeLa229细胞移植瘤模型中，尾静脉注射的DY755-Z384-Z228荧光蛋白呈现出5min全身分布，随后逐渐向左右肿瘤部位聚集，4小时达到最高峰，随后慢慢消退，持续至48小时，与仅对16E7特异性识别的DY755-Z384-2，18E7特异性识别的DY755-Z228-2相比较而言，DY755-Z384-Z228体现了双重识别能力，而在尾静脉注射所有近红外荧光标记重组蛋白的对照A375荷瘤裸鼠组中均没有出现一个特异性的肿瘤部位的荧光聚集。 结论：⑴成功表达了对HPV16E7和HPV18E7具有双特异性结合的affibody分子重组蛋白；⑵通过表面等离子体共振（SPR）技术及间接细胞免疫荧光、免疫组织化学术分别在蛋白水平、细胞水平和组织水平鉴定了三个重组蛋白与相应肿瘤细胞均具有亲和力和靶向特异性结合能力；⑶Z384-Z228双特异亲和体具有同时抑制Siha和HeLa229细胞生长作用；⑷成功建立了宫颈癌裸鼠皮下移植瘤模型；⑸成功用Dylight标记重组蛋白，并验证了其在裸鼠活体体内主要通过肾脏代谢；⑹小动物近红外成像证实Z384-Z228双特异亲和体同时具备靶向于Siha和HeLa229肿瘤的作用。