水稻（Oryza sativa）是最重要的粮食作物之一。随着水稻全基因组序列的测定，以解析水稻全部基因功能为目标的功能基因组研究已成为水稻基因组学研究的重点。大型突变体库是水稻功能基因组研究的重要技术平台，插入突变群体是这一平台的一个主要技术支撑。由于插入突变体突变表型和基因型之间的关联可以便捷地通过分离插入元件的侧翼序列进行鉴定，侧翼序列分离便成为利用插入突变群体进行功能基因组研究的关键工作。tRNA是蛋白质合成等多种生命活动不可或缺的重要组分。tRNA以前体形式转录，需要去除5和3端附加序列等一系列加工才能成为有活性的功能分子。目前植物中关于tRNA3端加工的分子机制还所知甚少。本研究以本实验室建立的RMD大规模T-DNA插入突变体库为材料，进行了大量的侧翼序列分离和突变表型筛选工作。在此基础上，本研究结合农杆菌侵染后6小时水稻愈伤组织的表达谱数据和72，090条侧翼序列对T-DNA和Tos17插入位点的分布与序列特征进行了分析，并对影响插入位点发掘的因素进行了推测。此外，本研究还利用一个白化苗突变体克隆和鉴定了一个参与叶绿体tRNA3端加工的tRNase Z编码基因，OsaTRZ2。　　本研究主要内容包括：⑴完成了对2，037个T0代独立转化植株的PCR阳性检测，阳性率为85.7％。⑵使用TAIL-PCR、反向PCR和接头PCR等方法从7，548份突变体材料中分离到5，711条可定位于水稻基因组上的T-DNA和Tos17侧翼序列（E-value＜10-5）。⑶通过分析T-DNA和Tos17插入位点在基因组不同层级上的分布发现中花11号和日本晴遗传背景下T-DNA和Tos17插入位点分别展示出了相似的分布特征，表明不同粳稻遗传背景下影响插入位点发掘的因素类似。⑷通过分析转录活性分布与T-DNA或Tos17插入位点分布的相关性发现T-DNA插入位点的分布在全基因组范围内，尤其在基因区内，与染色质转录活性呈高度正相关。而Tos17插入位点的主要集中区有一半都位于染色质上转录活性相对较低的区域，并且在基因区内Tos17插入位点的分布与基因表达量呈高度负相关。这些结果提示染色质转录活性是影响插入位点发掘的重要因素。⑸通过对插入位点临近序列的核苷酸组成进行分析发现在T-DNA和Tos17插入位点的3下游都出现了AT含量的上升，但上升的程度与插入位点的数量呈反比，推测PCR技术对富含AT序列的偏爱是造成这种特征的原因。⑹通过对插入位点的核苷酸组成进行分析发现G频率在T-DNA左端插入位点5上游5 bp范围内出现连续的2％左右的下降，而在T-DNA右端插入位点5上游3 bp到3下游1 bp位置上出现了2％-7％左右的上升。T-DNA左右端插入位点这种特异而微弱的碱基偏爱与T-DNA的微同源整合机制相符合。Tos17右端插入位点处出现了强烈的碱基偏爱，其一致序列为ANGTTGNNNCAACNT，可能是由Tos17的整合机制造成的。⑺通过对11，469个T1代突变体家系的田间表型筛选获得了105个表型稳定的穗部突变体家系和149个叶色突变体家系，包括4个T-DNA插入与突变表型共分离的家系:LT71、06LT90、LT30和OsaTRZ2。⑻OsaTRZ2是一个白化苗家系，osatrz2突变体发芽后存活不超过4周。色素和细胞学分析表明osatrz2的叶片缺乏叶绿素并且叶片中原质体的发育停滞在向叶绿体转化的早期阶段，而osatrz2愈伤细胞中质体的数量和大小也都极度降低。⑼RT-PCR和共分离检测表明白化表型是由于T-DNA插入到OsaTRZ2的第7个外显子中导致转录本被截短造成的。基因组注释表明OsaTRZ2编码一个365氨基酸长的tRNase Z。⑽遗传互补和双链RNA干涉实验证实OsaTRZ2的破坏是造成白化表型的原因。⑾表达分析和芯片数据表明OsaTRZ2在水稻组织中呈组成型表达，但在叶片、叶鞘和愈伤等绿色组织和活跃的分生组织中表达量较高。⑿亚细胞定位实验表明OsaTRZ2定位于叶绿体中。⒀体内和体外酶活实验都表明OsaTRZ2具有切除tRNA前体3端尾巴的活性。⒁对转录产物的分析表明OsaTRZ2失活后质体编码的RNA聚合酶与细胞核编码的RNA聚合酶的转录分别受到严重抑制和中等程度激活。