研究背景：铜绿假单胞菌(PA)是临床常见的院内获得性感染致病菌之一,是较难医治的革兰氏阴性杆菌之一。在有结构性肺病、肺间质纤维化、呼吸衰竭的患者中易引起难治的下呼吸道感染。PA易产生耐药,其耐药机制复杂,目前已经出现对碳青霉烯类抗生素、头孢菌素、含酶抑制剂的抗生素耐药的多重耐药或泛耐药PA,临床治疗PA感染的难度日益增大,抗生素选择压力大,PA导致的感染的病死率高。目前在国内外抗感染领域对生物被膜PA耐药机制的研究成为新的研究热点,以下是现有的研究成果。PA对不同抗生素的耐药机制不同。针对PA感染的难治性,国内外学者对PA的耐药机制进行了大量的研究。PA有多种耐药机制,主要包括形成生物被膜、降低外膜通透性、产生β-内酰胺酶、存在于外膜的独特主动泵出药物系统、D2外膜蛋白缺失、产生氨基糖苷类钝化酶以及改变药物作用靶位。生物被膜形成和β-内酰胺酶的产生是PA耐药的主要机制。生物被膜是细菌常见的生长方式,其与浮游状态相对应,为对抗外界的侵袭,细菌在生长过程中吸附于活性材料或惰性表面形成生物被膜。生物被膜由主要包含两部分：细菌和及其自身分泌的胞外基质,生物被膜是一种高度组织群体,具有高度的功能性、结构性和协调性。其生物学特性与浮游菌显著不同,生物被膜菌的耐药性较浮游菌明显增加,有更强的环境适应能力,使临床上与细菌生物被膜有关的许多感染性疾病难以治愈。针对细菌生物被膜感染,研究生物被膜内细菌的耐药机制有非常重要的意义。国内外研究表明生物被膜耐药存在多种综合因素。在表面黏附的早期生物被膜阶段,特定的细菌基因表达被诱导,特定生物被膜表型产生,生物被膜菌耐药性较浮游菌明显增加。此后,生物被膜菌分泌大量外多糖基质,外多糖基质作为屏障作用降低了抗生素的渗透性,生物被膜不易被杀灭。成熟的生物被膜生成后,自内向外菌体密度增加形成了氧浓度和营养成分梯度,生物被膜菌的生长速度和代谢活性减慢,由于菌体密度的增加激活密度感知系统。另外,营养成分缺乏和氧供的不足等因素导致综合广泛性的应激反应和多药物外排泵基因上调表达。表型变异、具有顽固耐药表型的的菌株在生物被膜内的特殊环境因素产生,使生物被膜内细菌对多种抗生素产生耐药。生物被膜不是细菌随意堆积形成的,而是一种相互协调构成高度分化结构的群体。从浮游菌到形成生物被膜菌,存在许多互相联系的信号传导通路。生物被膜菌通过这些信号传导系统在彼此之间相互协调其生理活动以趋利避害。密度感知系统是目前受到广泛关注的细菌信号传导系统,目前研究证实细菌的许多发病机制受密度感知系统调控。多数革兰阳性球菌分泌多肽类物质来作为密度感知系统的传递信号,而大多数革兰阴性杆菌的密度感知系统则是使用了一种叫做N-Acy1乙酰高丝氨酸内脂(AHL, N-Acylhomoserine lactone)的信号分子。PA的密度感知系统包含了las和rhl两类系统,需要两种激活转录蛋白lasR和rhlR以及PAI-1和PAI-2识别信号分子的参与。las系统包括Lasl(催化PAI-1合成)和LasR(一种正向转录激活蛋白)；rhl系统包括Rhll(催化PAI-2合成)和RhlR。PA转录多种毒力因子受LasR和RhlR协调,如除铁色素、超氧化物歧化酶、溶血素、蛋白酶、蛋白弹性酶、壳多糖酶及碱性蛋白酶等。密度感知系统在PA生物被膜形成的过程中发挥着重要的作用,其不仅通过调控。因子Rpos的合成影响控制生物被膜的综合应激反应(general stress response, GSR),而且影响着EPS的合成。GSR激活使细菌对环境压力(如：氧化作用、养分不足、DNA损害和渗透压以及温度变化等)的抵抗性增强。GSR的调控器是。因子Rpos,而后者又受密度感知系统的调控。密度感知系统功能异常将生物被膜的形成受到明显影响。研究表明标准菌株的生物被膜对抗生素的敏感性比由lasl和rhll突变体形成的生物被膜更弱,后者形成的生物被膜非常不稳定,其生物被膜内的细菌大多数易消散、脱离。国外研究表明在PA的lasl和rhll突变体中细菌存在颤动能力的缺陷,而颤动能力缺陷不利于生物被膜的形成。研究者发现其它的关键调节基因的次级变异可能与此有关,Ias系统和rhl系统突变也许导致这些调节基因的次级突变。密度感知系统在PA的生物被膜结构的形成及其分化中均起了特别的重要作用。国外学者报道了这些信号分子对PA生物被膜形成的作用,他们观察了标准菌株PA(PAO1)和Las-Rhl双突变菌株PAO1-JP2(不能产生两种信号分子PAI-2和PAI-1)的生物被膜生长情况,体外实验发现上述两种细菌在玻璃表面均能够粘附并且增殖,并且均可以在2周内达到稳态。但PAO-1生物被膜明显厚于PAO1-JP2的生物被膜的厚度,PAO1-JP2生物被膜的厚度仅是PAO-1菌株生物被膜的的1/5,并且PAO1-JP2生物被膜细菌分布较密集,PAO1-JP2表现为在玻璃上连续生长成片状,而PAO-1菌株有水通道在生物被膜细菌之间存在。PA中包括两个级联的密度感知系统,LasR-Lasl系统是控制细胞外毒力因子表达,RhlR-Rhll系统主要是控制某些二级代谢产物,前者对后者有调控作用。但目前国内外研究尚未明确对于PA生物被膜生成究竟需要las、rhl还是las-rhl。本实验通过光学显微镜观察PAO-1和不同突变菌株{PAO-MW1(PA01lasl、rhll基因缺陷型)、PAO-JP1(PAO1lasl基因缺陷型)和PDO100(PAO1rhll基因缺陷型)}的8h、1d、3d、6d、12d的生物被膜的形态的差异,以确立两个密度感知系统在生物被膜形成过程中的地位。β-内酰胺类抗生素是临床细菌感染治疗的常用药物。β-内酰胺类抗生素在全世界范围内的耐药率在不断上升,生成β-内酰胺酶是细菌对此类抗生素最常见的产生耐药的方式。不断有新的β-内酰胺类广谱抗生素的出现和临床广泛使用,多种不同的β-内酰胺酶的产生导致对新的β-内酰胺类抗生素产生耐药,如质粒介导的AmpC酶、碳青霉烯酶、超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)等。通过经典的水解反应,β-内酰胺酶可以破坏β内酰胺类抗生素,大量产生的酶分子和渗入细菌体内的抗生素相结合,使抗感染药物不能到达靶位。有很多种类的β-内酰胺酶,它们的特性也不同,一般分类是按结构分类和功能分类,功能分类应用的最为广泛,分为1-4组；按分子生物学分类,可以分为A～D4类,除B类为金属酶以外,其它三类的活性位点均为丝氨酸残基。上述的二种分类方法有较好的一致性,1组属于C类,除了2d组属于A/D类外,2组属于A类酶,3组属于B类酶。诱导酶(IB),如AmpC酶,属于1组,分子生物学C类；碳青霉烯酶属于第2d、2f亚组和3组,包括Ambler分子分类为A类、B类、D类的3类酶；超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)属于2be组,分子生物学A类。PA对β-内酰胺类抗生素耐药的重要机制之一是产生β-内酰胺酶。近年来,在PA中发现了多种类型的β-内酰胺酶,如A类β-内酰胺酶PER-1-2、VEB-1、 SHV-2a、SHV-5、SHV-12、TEM-24、TEM-42等。B类β-内酰胺酶IMP-1、IMP-7、 VIM-1～3等。C类β-内酰胺酶有DHA、MIR型AmpC酶。发现了OXA-11、OXA-14～19、OXA-28等多种D类β-内酰胺酶。细菌主要由质粒介导和染色体介导对β-内酰胺类抗生素产生耐药。染色体介导的耐药性可以子代垂直传播。质粒介导的β-内酰胺酶,在同种或不同种属间水平能通过转化、传导、传递、结合等不同方式传播。多项国外研究证实PA中许多基因受密度感知系统调控,这些基因中包含许多调控毒力因子表达的基因。随着PA基因测序的完成和微阵列技术的应用,对密度感知系统的调控作用能有一个更加完整和系统的评价。国外的三个不同的研究小组利用微阵列技术对PA中由密度感知系统调控的转录组学进行了研究,在研究使用了PA的不同形式的变异株。在实验中分别采用不加或加入3O-C12-HSL和C4-HSL,以密度感知系统调控观察基因的表达水平。研究结果显示很大一部分PA基因受密度感知系统调控。上述研究未发现密度感知系统对AmpC基因有明显的调控作用。这些研究未检测抗生素诱导状态下密度感知系统对基因转录的调控,因AmpC酶是诱导酶,本实验实时荧光定量PCR方法测定在抗生素诱导状态下PAO-1和密度感知系统突变菌株AmpC基因表达水平的差异,研究两类密度感知系统对PA的AmpC基因表达量的调控作用。随着PA多重耐药性问题日益严重,抗菌药物不能根治PA引起的相关感染。许多研究正在寻找一种新的抗感染治疗机制。既然在PA中密度感知系统调控一系列毒性因子,缺少了密度感知系统的菌株其毒力将减弱,故有学者提出将密度感知系统作为抑制PA感染的新靶点。RhlR和LasR的活化、AHLs的形成和活性和lasl/lasR和rhll/rhlR的表达可作为调控密度感知系统的重要环节。利用AHLs类似物作为C4-HSL和3O-C12-HSL的拮抗剂是通过抑制LasR和RhlR活化环节调控密度感知系统,这些类似物从结构上要跟PA产生的AHLs分子相似并能与RhlR和LasR蛋白结合。国外研究证实,利用报告分析法鉴定出一组带有氢结合受体的苯胺环结构化合物能与3O-C12-AHSL竞争结合LasR蛋白并抑制其活化及弹性蛋白酶的产生。类似研究在阐释可能有拮抗作用的一些药物时非常有用,并能在AHLs与LasR/RhlR如何相互作用方面提高认识水平。卤代呋喃酮化合物是目前抑制密度感知系统作用的研究热点,这种化合物能抑制密度感知系统诱导产生的许多因子。利用微点阵分析技术对卤代呋喃酮处理的PA时发现80%受密度感知系统调控的基因得到抑制,这显示了卤代呋喃酮化合物对密度感知系统抑制的特异性。这些化合物以及其它类似物为治疗PA感染提供了非常广阔的前景。本实验通过测定密度感知系统抑制剂呋喃酮C-30对PAO-1的AmpC基因表达量的影响,进一步研究密度感知系统对PA的AmpC基因表达量的调控作用。综合上述,本研究分为两部分。第一部分Las密度感知系统对PA生物被膜形成的调控作用。产酶基因AmpC在浮游和生物被膜状态下的表达差异。第二部分Las密度感知系统对AmpC基因表达水平的调控作用。第一部分Las密度感知系统对PA生物被膜形成的调控作用。产酶基因AmpC在浮游和生物被膜状态下的表达差异。目的：研究不同生长阶段的铜绿假单胞菌标准菌株PAO-1和密度感知系统突变菌株生物被膜形态的差异,研究抗生素诱导前后PA的AmpC基因表达水平的差异,产酶基因AmpC在浮游和不同生长阶段生物被膜状态下的表达差异。方法：改良的动态造膜方法,运用营养液输注泵控制菌液的流速及温度,在营养液输注泵管上建立PA生物被膜模型,银染法鉴定生物被膜生成,本实验通过光学显微镜观察PAO-1和不同突变菌株{PAO-MW1(PAO1lasl、rhll基因缺陷型)、PAO-JP1(PAO1lasl基因缺陷型)和PDO100(PAO1rhll基因缺陷型)}的8h、1d、3d、6d、12d的生物被膜的形态的差异。用全自动药敏分析仪分别测定浮游菌和生物被膜菌对亚胺培南和头孢他啶的MIC。首先应用测定浮游菌和建立的8h、1d、3d、6d、12d生物被膜菌产最大AmpC酶活性的亚胺培南和头孢他啶的浓度,将浮游菌和建立的8h、1d、3d、6d、12d生物被膜菌分别运含有上述浓度的抗生素的培养基诱导AmpC基因表达。采用实时荧光定量PCR方法测定抗生素诱导前后PAO-1的AmpC基因表达水平,产酶基因AmpC在PAO-1的浮游和不同生长阶段生物被膜状态下的表达量。结果：PA01培养8h、1d生物被膜银染照片,未见黑染棉絮状物质,细菌呈短杆状,菌体长短不一,彼此聚集成堆。PA01培养3d、6d生物被膜银染照片,形成较为成熟的生物被膜,生物被膜被染成黑褐色,棉絮状,分布不均匀。培养6天后成熟的生物被膜,染成黑褐色的生物被膜较培养3天的生物被膜增多,更为浓密。PA01培养12d银染照片,黑染棉絮状生物被膜消退。PAO-1和突变菌株PD0100培养6天后形成成熟的生物被膜,可见浓厚的黑染棉絮状生物被膜。培养6天后突变菌株PAO-JP1和PAO-MW1形成的生物被膜,染成黑褐色的生物被膜较少,分布不均匀。浮游菌和8h、1d、3d、6d、12d生物被膜菌对亚胺培南和头孢他啶的MIC均为4mg/L,生物被膜菌经超声震荡脱膜后测定对这两种药物的MIC未发生改变。随着生物被膜的成熟,诱导产生最大AmpC酶活性所需的抗生素浓度增高。测定浮游菌和建立的8h、1d、3d、6d、12d生物被膜菌产最大AmpC酶活性的亚胺培南浓度,分别为2mg/L (1/2MIC)、2mg/L (1/2MIC)、8mg/L (2MIC)16mg/L (4MIC)、16mg/L (4MIC)、8mg/L (2MIC)测定浮游菌和建立的8h、1d、3d、6d、12d生物被膜菌产最大AmpC酶活性的头孢他啶浓度,分别为2mg/L(1/2MIC)、8mg/L (2MIC)、24mg/L (6MIC)、40mg/L (10MIC)、48mg/L (12MIC)、24mg/L (6MIC)。PA标准菌株PA01在未经抗生素诱导的状态下,浮游菌和生物被膜菌的AmpC基因表达水平均较低,两者之间差异无统计学意义。在产最大AmpC酶活性浓度的抗生素诱导下,PA01浮游菌的AmpC基因表达水平明显升高。在浮游菌状态下和各阶段生物被膜的状态下亚胺培南诱导的AmpC基因表达水平均高于头孢他定,两者之间差异有高度统计学意义。PA01在产最大AmpC酶活性浓度抗生素诱导的状态下,除12d生物被膜菌以外其余各阶段生物被膜的AmpC基因表达水平均高于浮游菌。随着生物被膜逐渐成熟增厚,抗生素诱导后AmpC基因表达水平渐增高,6d生物被膜的AmpC基因表达量最高。至12d的生物被膜,抗生素诱导后AmpC基因表达量降低,与浮游菌、8h、1d生物被膜AmpC基因表达量,差别无统计学意义。结论：las密度感知系统直接或间接调控铜绿假单胞菌生物被膜形成。生物被膜铜绿假单胞菌被诱导产生AmpC酶的能力高于浮游菌,亚胺培南的诱导铜绿假单胞菌产生AmpC酶能力高于头孢他定。第二部分Las密度感知系统对AmpC基因表达水平的调控作用。目的：研究PAO-1和密度感知系统突变菌株AmpC基因表达水平的差异,密度感知系统抑制剂呋喃酮C-30对PAO-1的AmpC基因表达量的影响,研究Las密度感知系统对PA的AmpC基因表达量的调控作用。方法：研究呋喃酮C-30对抗生素诱导的PA01的AmpC基因表达水平的影响,在第一部分研究所述诱导过程中将呋喃酮C-30与抗生素同时加入培养基。培养基中呋喃酮C-30的浓度分别为2.5μg/ml、5μg/ml,生物被膜菌诱导后经超声振荡脱膜100W×15min。采用实时荧光定量PCR方法测定PAO-1和密度感知系统突变菌株AmpC基因表达水平,并测定加用密度感知系统抑制剂呋喃酮C-30后PAO-1的AmpC基因表达水平。结果：加入呋喃酮C-30后,抗生素诱导的PA01浮游菌和各阶段生物被膜菌AmpC基因表达水平均降低,随着呋喃酮C-30浓度增大,AmpC基因表达水平降低更明显。分别加入2.5μg/ml、5μg/ml呋喃酮C-30后,抗生素诱导的PAO1浮游菌AmpC基因表达水平均降低。除亚胺培南诱导PA01的12d生物被膜状态以外,加入5μg/ml呋喃酮C-30后,抗生素诱导的浮游菌和各阶段生物被膜菌AmpC基因表达水平较加入2.5μ/ml呋喃酮C-30降低更明显,差异有高度统计学意义。抗生素诱导的成熟生物被膜菌分别经呋喃酮C-30作用后AmpC基因表达水平降低程度较浮游菌、8h生物被膜菌、12d生物被膜菌更明显.抗生素诱导PAO-MW1、PAO-JP1的AmpC基因表达水平低于PA01；抗生素诱导PAO-MW1、PAO-JP1的AmpC基因表达水平低于PDO100。6d生物被膜菌状态下,亚胺培南诱导PAO-MW1与PAO1AmpC基因表达差异较浮游菌状态两者表达差异更大。结论：生物被膜菌较浮游菌易诱导产β-内酰胺酶与密度感知系统在不同状态下发挥的调控作用水平有关。las密度感知系统直接或间接调控PA的AmpC基因诱导表达,而rhl密度感知系统较少或是未参与AmpC基因表达调控。