兽药在畜牧业快速发展过程中发挥着不可替代的作用,四环素类药物作为一类广谱抗生素被广泛用于治疗动物的多种感染性疾病。但此类药物在动物性食品中的残留会给消费者带来一系列潜在的健康危害。本论文的目的是制备出四环素类药物的受体TetR蛋白并对其进行定向进化,以其为识别元件建立新型免疫法对此类药物在动物性食品中的残留进行检测。首先,研究者从四环素耐药菌中提取总DNA,利用PCR技术扩增出TetR蛋白的基因,将其插入表达载体并导入BL21(DE3)感受态细胞中进行表达。结果表明,该TetR蛋白的分子量为44 KDa,能同时识别5种四环素类药物,IC50为2.37-31 ng/mL。分子对接的结果表明,该受体的结合位点由12个氨基酸组成,它们主要通过疏水作用力和pi-pi键与药物分子中的D环发生结合。以该TetR蛋白为核心试剂建立的竞争化学发光免疫法可以对牛奶中的这5种四环素类药物进行检测,检测限为1.24-15.7 ng/mL,添加回收率为77-96%。然后,研究者对TetR蛋白中的关键接触氨基酸分别进行了虚拟突变。结果表明,将105位脯氨酸突变为苯丙氨酸和酪氨酸时,受体的稳定性明显提升。于是研究者对TetR基因进行了定点突变,制备出了两种TetR突变体。二次分子对接表明,突变体的关键接触氨基酸数量增加了 8种,受体-药物结合能明显升高。同时,两种突变体可识别7种四环素类药物,IC50为3.1-17.2 ng/mL,比原型TetR的灵敏度提高了 3-10倍。以突变体2为识别元件建立的竞争荧光免疫法可以对鸡蛋中的7种四环素类药物行检测,检测限为2.0-8.7 ng/mL,添加回收率为68.4-91.2%。最后,研究者合成了一种分子印迹-金属有机框架材料复合物,建立了一种固相分散萃取法并结合超高效液相色谱法对鸡肉中的7种四环素类药物进行检测。结果表明,该复合物可以特异性识别四环素类药物,吸附容量大(3 pg/g),回收率高(95%-98%),富集倍数高(17-37),可重复使用7次。该方法对7种药物的检测限为3-16 ng/mL,添加回收率为89%-96%。本论文成功制备出了四环素类药物的受体TetR蛋白并对其进行了定向进化,初步探明了它们的分子识别机制。基于受体/突变体的新型免疫法可以对牛奶和鸡蛋中此类药物的残留进行快速检测,对保障动物性食品安全具有重要意义。